耐藥基因 CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 和 FLU1在假絲酵母菌株中的分布情況

張麗梅，譚皓妍，徐韞健，李倩珺

(1 廣州醫學院第一附屬醫院，廣州 510120;2 廣州市海珠區沙園街衛生服務中心)

復發性外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)是指1年中發生4次或以上的外陰陰道念珠菌病，其發病率約占外陰陰道念珠菌病患者的5%［1］，是婦科常見癥、多發病，容易復發，難以根治。假絲酵母菌是常見條件致病菌，以白色假絲酵母菌多見。本研究通過基因測序，分析耐藥基因CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1在假絲酵母菌株內的表達，探討假絲酵母菌耐藥的分子機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2011年6月在廣州醫學院第一附屬醫院就診的RVVC患者58例，年齡20～52歲，均有典型的豆渣樣白帶和外陰瘙癢等癥狀，白帶常規鏡檢發現菌絲或孢子，每年復發4次以上。

1.2 方法

1.2.1 標本分離與鑒定 取患者的白帶標本，常規接種于沙氏平板培養24 h，取直徑0.5～1.5 mm、光滑、凸起、濕潤的小白菌落涂片鏡檢。如為假絲酵母菌，取菌落接種在科瑪嘉(CHROMagar)念珠菌顯色平板上，35℃培養24 h，觀察結果。不能鑒定的用Vitek-2全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定。質控菌株ATCC64548、ATCC45550購自衛生部藥物鑒定所。

1.2.2 藥敏試驗 將已鑒定的假絲酵母菌、質控菌株ATCC64548和ATCC45550分別用生理鹽水配制成0.25麥氏比濁懸液，均勻涂布于真菌藥敏平板上。藥敏紙片選用5-氟胞嘧啶(5-Fu)、兩性霉素B(AMP)、氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、咪康唑(MIC)。35℃孵育24 h，量取藥敏環直徑，5-Fu＞20 mm、AMP＞15 mm、FCA＞22 mm、ITR ＞16 mm、MIC＞20 mm判斷為敏感;5-Fu＜11 mm、AMP＜10 mm、FCA ＜14 mm、ITR＜9 mm、MIC＜12 mm判斷為耐藥。

1.2.3 酵母菌DNA的抽提 收集58株假絲酵母菌，接種于沙保羅平板，35℃培養24 h，挑取單個菌落接種到沙保羅肉湯，35℃培養24 h，取培養液置于1.5 mL EP管中，離心去上清，向沉淀中加入500 μL的Solution A，輕微振蕩并充分懸浮沉淀，于37℃溫浴1 h，加入100 μL的Solution B，輕微振蕩混勻后于70℃溫浴10 min，加入200 μL的Solution C，輕微振蕩混勻后，冰上冷卻5 min，4℃離心5 min，將上清移入新的1.5 mL的EP管中。加入上清液1/2體積的異丙醇，充分混勻，4℃離心5 min，棄上清，向沉淀中加入500 μL預冷的70%乙醇，洗滌沉淀，4℃離心5 min，棄上清，保留DNA沉淀室溫干燥，加入適量TE Buffer溶解基因組DNA。

1.2.4 PCR擴增 根據 Genbank中假絲酵母菌CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 和 FLU1 基因序列設計引物，引物由上海英俊生物公司合成。見表1。PCR 擴增反應體系為 20 μL，上下游引物各 1 μL，10 × PCR 緩沖液2 μL，150 μL/L dNTP 1 μL，Taq 酶0.25 μL，ddH2O 12.75 μL，DNA 模板 2 μL。反應條件:95℃預變性3 min，95℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃50 s，共循環35次，最后72℃延伸10 min。擴增產物以1.2%瓊脂糖凝膠(加EB)電泳，凝膠成像系統觀察結果。PCR產物送華大基因公司進行雙向測序，測序結果在GenBank上進行查詢比對。

2 結果

2.1 假絲酵母菌鑒定結果 臨床分離假絲酵母菌58株，其中白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、乳酒假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌分別為45(77.6%)、3(5.1%)、1(1.7%)、8(13.8%)、1 株(1.7%)。主要致病菌為白假絲酵母菌 45株(77.6%);非白假絲酵母菌中，光滑假絲酵母菌致病率最高，為13.8%。

2.2 假絲酵母菌耐藥基因檢測結果 用聚合酶鏈反應PCR擴增耐藥基因組CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和 FLU1，陽性率分別為62.1%(36/58)、60.3%(35/58)、56.9%(33/58)、62.1%(36/58)和0。擴增產物經凝膠電泳后進行分析，PCR產物測序結果在GenBank上進行查詢比對，與已在美國生物信息中心登錄的CDR1、CDR2、ERG11和CaMDR1基因序列分別為 100%、98.0%、99.0%、99.0% 相同。

表1 PCR引物情況表

2.3 假絲酵母菌藥敏試驗結果分析 5-Fu和MIC的耐藥率較高，并出現多重耐藥情況，AMP和FCA的耐藥率較低。見表2。58株假絲酵母菌中有3例對FCA耐藥，其中白假絲酵母菌1例，光滑假絲酵母菌2例。

表2 假絲酵母菌藥敏試驗結果

3 討論

RVVC容易復發，難以根治。RVVC患者中，由假絲酵母菌屬中的白假絲酵母菌引起的感染占大多數，非白假絲酵母菌如熱帶假絲酵母菌、乳酒假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌等也占有相當比例，文獻報道為 20% ～30%［2］。Richter等［3］對84例RVVC患者陰道分泌物的培養結果顯示，非白假絲酵母菌為42%，而同期收集的 VVC患者為20%。由于非白假絲酵母菌與白假絲酵母菌在對黏膜的黏附性強弱、分泌型蛋白酶的產生及藥物敏感性方面均有很大差異，因此增加了其治療難度。張洪文等［4］報道，RVVC非白假絲酵母菌感染高于VVC，兩者非白假絲酵母菌感染中均以光滑假絲酵母菌為主。張雨華等［5］報道，深圳地區RVVC主要致病菌為白假絲酵母菌(占71.8%)，非白假絲酵母菌中光滑假絲酵母菌致病率最高(占11.8%)。本研究中，RVVC患者白帶標本致病菌為白假絲酵母菌(占77.6%)，非白假絲酵母菌中光滑假絲酵母菌致病率最高(13.8%)，與文獻報道相近，表明白假絲酵母菌是RVVC的主要致病菌。

目前，治療假絲酵母菌感染的藥物主要有唑類(如FCA)、多烯類(如AMP)、棘球白素類(如卡泊芬凈)和嘧啶類(如5-Fu)。其中FCA具有水溶性、口服生物利用度高(可達90%以上)、不良反應小等特點，是最常用的抗真菌藥。本研究58株假絲酵母菌中，5-Fu和MIC的耐藥率較高，分別為10.3%和17.2%;AMP和 FCA的耐藥率較低，分別為3.4%和5.2%;其中對FCA耐藥3例(1例為白假絲酵母菌，2例為光滑假絲酵母菌)。由于FCA的廣泛和長期使用，近10年來臨床上約有90%的菌株有不同程度的耐藥性，且具有交叉耐藥性，逐漸占酵母樣真菌耐藥的首位，是導致RVVC臨床治療失敗的主要原因。

假絲酵母菌耐藥是近年研究的熱點。唑類耐藥的主要原因包括麥角固醇合成通路的改變和細胞膜多藥耐藥蛋白的高表達。在細胞整體水平上，物質代謝通路的改變必然對應著基因水平上參與此物質代謝相關基因的改變，ERG11、ERG5等麥角固醇合成通路中關鍵基因的過表達或突變，引起多種代謝通路的變化。另外，假絲酵母菌耐藥為編碼外排泵ATP結合轉運蛋白超家族的基因CDR1、CDR2和編碼主要易化擴散載體超家族的基因MDR1和FLU1的過表達，而藥物外排能力的增強導致胞內藥物濃度降低，可能是白色念珠菌最主要的耐藥機制［6，7］。本研究結果顯示，假絲酵母菌耐藥基因組CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1在RVVC患者中的陽性率分別為 62.1%、60.3%、56.9%、62.1% 和 0。CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 在敏感和耐藥的白假絲酵母菌中均能檢測到，與文獻［8］報道一致。提示白假絲酵母菌無論是耐藥還是敏感，都存在CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 的表達，都有可能出現對抗真菌藥物的耐藥現象，但耐藥基因的產生并不代表假絲酵母菌耐藥現象的出現，耐藥現象是在多種機制共同作用下逐漸形成的，CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1的表達量與菌株耐藥性的關系有待進一步研究。

［1］Lanchares JL，Hernandez ML.Recurrent vaginal candidiasis changes in etiopathogenical patterns［J］.Gynaecol Obstet，2000，71(1):S29-35.

［2］王建紅.念珠菌性陰道炎病原學變化及耐藥情況分析［J］.河北醫藥，2004，26(12):955-955.

［3］Richter SS，Galask RP，Messer SA，et al.Antifungal susceptibilities of Candida species causing vulvovaginitis and epidemiology of recurrent cases［J］.Clin Microbiol，2005，43(5):2155-2162.

［4］張洪文，羅萍，陳蒲香，等.RVVC患者陰道內念珠菌菌種情況的研究［J］.中國醫師雜志，2007，9(11):1536-1537.

［5］張雨華，鐘雪花，劉偉蓮，等.復發性外陰陰道念珠菌病致病菌藥敏檢測［J］.中國皮膚性病學雜志，2004，18(7):443.

［6］Wada S，Niimi M，Niimi K，et al.Candida glabrata ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Pdh1p expressed in a accharomyces cerevisiae strai deficient in membrane transporters how phorylation dependent pumping properties［J］.J Biol Chem，2002，277(48):46809-46821.

［7］Kontoyiannis DP，Lewis RE.Antifungal drug resistance of pathogenic fungi［J］.Lancet，2002，30(9312):1135-1144.

［8］廖偉嬌，郭曉婧，江潔華，等.123株白色念珠菌耐藥基因CDR1和 CDR2 表達研究［J］.中國熱帶醫學，2008，8(8):1828-1830.