TNF-α對骨結核破骨細胞誘導機制的研究

寧 旭，楊德猛，王長庚，李江偉，葉 川，任世超

(1 貴陽醫學院附屬醫院，貴陽 550004;2 江西省萍鄉市人民醫院)

結核桿菌(MTB)是對人類健康威脅最大的病原體之一。骨關節結核是由MTB通過血液或淋巴系統播散至骨與關節，造成血供豐富和負重大或活動較多的骨關節發生壞死，是發病率最高的肺外結核疾病，占肺外結核總發病率的35%［1］。研究表明，TNF-α能通過與破骨細胞前體細胞上的相應受體結合，直接或間接調節破骨細胞的分化、激活和凋亡［2-4］。但在骨關節結核發病過程中TNF-α是否調控破骨細胞分化、激活，導致骨破壞鮮見報道。2011年7月～2012年9月，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 3周齡雄性昆明小鼠6只，由第三軍醫大學實驗動物中心提供;標準MTB(mycobacterium tuberculosis H37rv)由貴陽醫學院微生物教研室提供。主要實驗材料有α-MEM培養基(Gibico)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(Sigma)，胎牛血清(南美Hyclone)，小鼠TNF-α試劑盒(ADL)。

1.2 方法

1.2.1 MTB凍干物的制備 取對數期MTB，加入無菌水，制成混懸液。超聲裂解組取MTB混懸液，冰浴條件下超聲裂解儀裂解，設置電壓300 W，超聲時間8 s，超聲間隔10 s，裂解30 min，所得混懸液低溫離心50 min，取上清液，0.45 μm 濾過膜過濾、分裝、凍干，4℃保存備用。熱處理組取MTB混懸液，80℃密封水浴30 min×2次，所得混懸液分裝、凍干，4℃保存備用。

1.2.2 小牛骨磨片的制備 取新鮮小牛四肢皮質骨，手工修成0.5 cm×0.5 cm 大小骨塊并打磨光滑，在5%戊二醛固定2 h后，用Leica硬組織切片機將骨塊切成10 μm厚骨片，依次行梯度乙醇脫水、0.25 mol/L稀氨水超聲清洗儀清洗3次，自然干燥后用鉛筆標記正反面，經γ射線照射消毒后，浸泡在含鏈霉素和青霉素各1000 U/mL的PBS液中，4℃保存備用。

1.2.3 小鼠破骨細胞的誘導與分組 將6只小鼠用脫髓法處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌操作下快速分離肱骨及股骨，剪去兩端骨骺，用α-MEM培養液(含1000 U/mL鏈霉素、1000 U/mL青霉素、15%胎牛血清)反復沖洗骨髓腔至顏色發白。收集骨髓細胞沖洗液，吹打混勻，過濾，離心棄上清;用α-MEM培養液重懸2次后接種于培養皿中，在5%CO2、37℃孵箱培養24 h，收集培養液，離心，重懸，計數，鏡下調節單核細胞密度至2.0×106/mL。接種0.5 mL細胞懸液于24孔培養板中(12個含骨磨片)。設熱處理組和超聲裂解組各5個副孔，其中1個空白對照，其他4孔分別加入熱處理MTB凍干物和超聲裂解MTB凍干物，調整MTB濃度至0.2、2、20、200 μg/mL，置入 5%CO2、37 ℃孵箱中培養，每48 h更換細胞培養液1次，始終維持各組MTB凍干物濃度不變，誘導7 d。

1.2.4 TNF-α 定量檢測 收集誘導 24、48 h后的細胞培養液，采用ELISA法檢測細胞培養液中的TNF-α濃度。首先于酶標儀中測定ELISA試劑盒中標準品在450 nm波長處的吸光度(OD)值，以OD值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據樣品的OD計算對應濃度值。

1.2.5 TRAP染色及骨陷窩的觀察、計數 細胞誘導7 d，傾去培養板中的培養液，用去離子水沖洗細胞3次，依照TRAP染色試劑盒說明書配置固定液及染色液，并將染色液水浴至37℃。固定液固定細胞30 s，棄固定液，沖洗3遍。每孔加入150 μL染色液，用錫箔紙包裹培養板后，置于37℃孵育箱中反應60 min，去離子水沖洗晾干。將骨磨片放入0.25 mol/L氨水中超聲洗滌5 min×3次，去除附著細胞，用1%甲苯胺藍溶液室溫染色3～4 min，1%鹽酸乙醇分化，丙酮脫水，蒸餾水清洗，室溫晾干。鏡下觀察每孔中TRAP陽性細胞(陽性細胞核≥3個)計數及骨陷窩情況。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件，結果用表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熱處理組和超聲裂解組TNF-α濃度比較 誘導24 h后，熱處理組中各濃度組與空白對照組比較均無統計學差異(P均 ＞0.05);超聲裂解組中除0.2 μg/mL組TNF-α濃度與空白對照組無統計學差異(P＞0.05)外，其余各濃度組均高于空白對照組(P均 ＜0.05)，且隨 MTB 濃度增加，TNF-α 濃度逐漸增加，不同濃度組間比較均有統計學差異(P均＜0.05)。誘導 48 h 后，超聲裂解組中除 0.2 μg/mL組TNF-α濃度與空白對照組無統計學差異(P＞0.05)外，其余各濃度組均高于空白對照組(P均＜0.05)，且隨 MTB濃度增加，TNF-α 濃度也逐漸增加，不同濃度組間比較均有統計學差異(P均 ＜0.05)。見表1。

2.2 熱處理組和超聲裂解組TRAP陽性細胞比較誘導7 d后，熱處理組中的實驗組和空白對照組均有少量TRAP陽性細胞形成，各組間比較無統計學差異(P均＞0.05)。超聲裂解組中各實驗組均有TRAP陽性細胞形成，除0.2 μg/mL組與空白對照組比較無統計學差異(P ＞0.05)外，2、20 μg/mL組與空白對照組比較均有統計學差異(P均＜0.05)，200 μg/mL 組在誘導培養 3 d 后，培養液中出現大量漂浮死亡細胞，鏡下觀察細胞形態及結構模糊、裂解。

表1 熱處理組和超聲裂解組誘導24、48 h后培養液中的TNF-α濃度比較(pg/mL，)

表1 熱處理組和超聲裂解組誘導24、48 h后培養液中的TNF-α濃度比較(pg/mL，)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05;超聲裂解組0.2、2、20、200 μg/mL 組間比較，P ＜0.05

組別 n 誘導24 h的TNF-α濃度 誘導48 h的TNF-α濃度5.160.2 μg/mL 組 30 77.72 ±3.67 94.06 ±6.54 92.24 ±7.68 104.06 ± 6.862 μg/mL 組 30 79.20 ±5.20 122.95 ±5.67* 96.45 ±9.79 314.95 ±10.82*20 μg/mL 組 30 77.40 ±5.03 150.54 ±6.62* 93.07 ±9.78 570.06 ±17.08*200 μg/mL 組 30 79.76 ±4.06 224.75 ±9.06* 96.54 ±9.67 633.64 ±20.17熱處理組 超聲裂解組空白對照組 30 76.78 ±4.56 92.91 ±4.25 95.81 ±5.84 102.62 ±熱處理組 超聲裂解組*

2.3 熱處理組和超聲裂解組骨吸收陷窩計數比較誘導7 d后，各組骨片均出現圓形、橢圓形或臘腸形的連續或不連續骨陷窩，熱處理組各濃度組與空白組比較均無統計學差異(P均＞0.05)。超聲裂解組中除0.2 μg/mL組與空白組無統計學差異(P＞0.05)外，其余各濃度組與空白組比較均有統計學差異(P均＜0.05)，且隨濃度增加，骨陷窩計數逐漸增大，但200 μg/mL組與20 μg/mL組比較明顯減少。見表2。

表2 熱處理組和超聲裂解組破骨細胞、骨陷窩計數比較(個，)

表2 熱處理組和超聲裂解組破骨細胞、骨陷窩計數比較(個，)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05;超聲裂解組0、2、20、200 μg/mL 組間比較，P ＜0.05

組別 n 破骨細胞計數骨陷窩計數30 3.67 ±1.37 3.51 ±2.24 4.50 ±2.26 5.27 ±2.160.2 μg/mL 組 30 3.83 ±2.64 8.17 ±2.79 5.83 ±1.47 7.17 ±1.172 μg/mL 組 30 4.33 ±2.50 17.00 ±4.89* 5.50 ±1.05 13.17 ±2.22*20 μg/mL 組 30 4.17 ±2.78 28.67 ±5.89* 5.67 ±1.86 28.33 ±4.22*200 μg/mL 組 30 4.67 ±1.97 0* 5.83 ±1.72 3.83 ±1.83熱處理組 超聲裂解組空白對照組熱處理組 超聲裂解組*

3 討論

骨關節結核患者骨質破壞的具體機制尚不明確。破骨細胞的成熟和活化主要依賴于成骨細胞表達核因子κB受體激活劑配體與破骨前體細胞表面核因子κB受體的結合，通過經典信號通路或旁路，導致破骨細胞成熟和活化［5］。當破骨細胞骨吸收活動與成骨細胞骨形成活動的動態平衡紊亂時，易導致骨吸收發生［6］。TNF-α在控制MTB感染過程中起重要作用。Al-Attiyah等［7］將肺結核患者的外周血單核細胞與MTB相關抗原體外共同培養2 d后，與空白組比較，實驗組細胞培養液中的TNF-α濃度明顯增高。本研究中，熱處理組與空白對照組相比，破骨細胞數目、培養液中的TNF-α濃度、骨陷窩計數均無統計學差異，表明熱處理MTB凍干物不能刺激骨髓單核細胞分泌TNF-α和誘導破骨細胞形成;超聲裂解組與空白對照組比較，破骨細胞數目、培養液中的TNF-α濃度、骨陷窩計數均高于對照組(0.2 μg/mL組除外)，表明超聲裂解MTB凍干物能刺激骨髓單核細胞分泌TNF-α和誘導破骨細胞形成，并導致骨質破壞。

超聲裂解組中，隨著MTB濃度和培養時間延長，細胞培養液中的TNF-α濃度逐漸增高，破骨細胞數量和骨陷窩計數逐漸增加。表明超聲裂解MTB凍干物能刺激骨髓單核細胞分泌TNF-α與受體結合，直接或間接激活 NF-κB、JNK、p38、ERK 等信號通路而調節破骨細胞形成、激活，從而調控破骨細胞形成及活化，導致骨質破壞。當超聲裂解MTB凍干物達到200 μg/mL時，誘導3 d后培養液出現大量漂浮死亡細胞，骨陷窩數明顯降低。其原因可能為培養液中TNF-α濃度過高致骨髓單核細胞及誘導形成的破骨細胞死亡［8］，也可能與高濃度超聲裂解MTB凍干物直接或間接導致細胞死亡有關。

MTB感染人體后，通過激活MAKP信號傳導通路促進單核細胞趨化因子、TNF-α合成及釋放，從而調控巨噬細胞、淋巴細胞對炎癥的反應，抑制細菌生長和誘導肉芽腫形成［9］。結核病是一種慢性疾病，MTB在肉芽腫和吞噬細胞中持續存在，MTB或其胞內蛋白很可能導致TNF-α高于正常水平;而TNF-α又能通過細胞間信號傳導誘導破骨細胞形成及活化，從而導致骨質破壞。這可能是MTB感染人體引起骨關節壞死的原因之一。

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