熒光假單孢菌的研究和應用

王東凱，黃國慶，吳 瓊，陳麗娟

(1.黑龍江省對俄工業(yè)技術合作中心，哈爾濱150090;2.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150020)

熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)是菌根促生細菌的主要類群，具有拮抗多種植物病原真菌的能力。在不同土壤和不同植物類型菌根際微生物群落有很大差異。Cristiana等研究證明被灰白松露(Tuber borchii)侵染的歐洲櫟(Quercus robur)菌根上多為熒光假單孢菌和皺紋假單孢菌(P.corrugata)，此類細菌具有促進菌根真菌孢子萌發(fā)和菌絲體生長的能力［1-3］。本項目是對從俄羅斯引進的菌根促生細菌與生物防治菌－熒光假單孢菌分離鑒定，發(fā)酵條件，菌劑制備和生物防治應用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種:由俄羅斯科學院分子遺傳研究所引進熒光假單孢菌菌劑。由黑龍江省科學院高研院微生物分子生物學試驗室分離、純化獲得，為熒光假單孢菌ELS—1菌株，用KB培養(yǎng)液活化、培養(yǎng)。供試病原菌為油菜菌核病菌由國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心提供，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 滑石粉(藥用滑石粉)等所用化學試劑均購于哈爾濱化學試劑公司。滑石粉載體材料經(jīng)兩次高壓滅菌，每次121℃，處理30 min，烘干備用。

1.1.3 立式全溫恒溫振蕩器IS－RDVI，哈爾濱東聯(lián)電子儀器廠生產(chǎn)。30立升不銹鋼發(fā)酵罐，BLBIO—30SJ型，上海百侖生物科技有限公司生產(chǎn)。高速冷凍離心機H2050R，湖南心湘儀生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 熒光假單孢菌菌株的分離純化鑒定方法，參照文獻進行［4-5］。分離出純化的單菌落，在試管斜面培養(yǎng)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 發(fā)酵條件的選擇，參照文獻并略加修改進行［6-7］。

1.2.3 熒光假單孢菌菌懸液的制備方法，參照文獻并略加修改進行［8-9］。發(fā)酵完成后，離心收集熒光假單孢菌ELS—1菌體，再用新鮮的KB液體培養(yǎng)基懸浮，使菌懸液中活菌數(shù)達到l×108個/mL。作為生防菌劑備用。

1.2.4 菌劑制備方法。參照文獻進行［8］。滑石粉和羧甲基纖維素鈉經(jīng)121℃高壓滅菌3次。每次滅菌30min，干燥后備用。前項所得到的菌懸浮，活菌數(shù)達到l×108個/mL以上。再加入少許2%的羧甲基纖維素鈉溶液，充分混勻后，按比例與滑石粉混合(100︰24，m︰v)，室溫放置48h后，裝袋密封，室溫貯藏。使用時，用平板計數(shù)法檢測菌劑中活菌數(shù)，檢測時重復3次。

1.2.5 菌劑中有效熒光假單孢菌ELS—1菌株菌體釋放率的測定，參照文獻進行［8］。

1.2.6 熒光假單孢菌ELS—1生防菌劑對油菜菌核病的防效試驗方法，參照文獻并略加修改進行［9－10］。

2 結果與分析

2.1 熒光假單孢菌的純化鑒定和菌落特征

按照文獻方法，在KB培養(yǎng)基上純化鑒定出熒光假單孢菌，在紫外燈下檢出產(chǎn)熒光的菌落，該菌在KB培養(yǎng)基上生長良好，如圖1，菌落微隆起，淡黃色，邊緣光滑，表面較濕潤，可產(chǎn)生水溶性黃綠色色素，紫外光照射下有黃綠色熒光產(chǎn)生，如圖2所示，革蘭氏陰性，桿狀，具極生鞭毛。

圖1 KB培養(yǎng)基上的熒光假單孢菌菌株ELS—1菌落Fig.1 Colonies of Pseudomonas fluorescens on KB medium

2.2 熒光假單孢菌生理生化特性

圖2 紫外光下熒光假單孢菌菌株ELS—1的熒光菌落Fig.2 Fluorescence colonies of ELS—1 under UV

篩選出的產(chǎn)熒光的細菌菌株ELS—1參照文獻并略加修改進行［8］。進行生理生化鑒定，結果與標準熒光假單孢菌相同。特性是最適生長溫度為28℃～30℃，低于4℃、高于41℃均不生長;產(chǎn)生熒光色素、不產(chǎn)生類胡蘿卜素和膿青素;可以利用檸檬酸鹽，對青霉素有抗性;氧化酶、接觸酶和精氨酸雙水解酶陽性，脂酶(Tween80)反應陰性;明膠液化、吲哚反應陽性，水解淀粉、反硝化、V—P反應陰性。定為熒光假單孢菌中的已知種。

2.3 篩選確定發(fā)酵條件及擴大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)熒光假單孢菌菌體

在搖瓶發(fā)酵所建立的發(fā)酵條件的基礎上，對工業(yè)培養(yǎng)基進行30 L發(fā)酵罐的放大試驗。由于發(fā)酵罐的攪拌和通氧條件均優(yōu)于搖瓶發(fā)酵，因此菌體濃度和茵體形態(tài)都明顯好于搖瓶發(fā)酵。由圖3和鏡檢可知，接種O～4 h，菌數(shù)很少，pH值變化很小;4～24 h為對數(shù)生長期，菌體數(shù)量迅速增加，pH急劇下降;24～36 h對數(shù)生長結束，菌體進入穩(wěn)定期，新陳代謝減慢，pH開始回升，桿狀菌體大量脫落形成球狀類芽孢菌體，28 h達到最大菌數(shù)178億/mL，32 h 95%的菌體形成整齊的球狀菌體，所以28～32 h為最佳放罐時間。然后進入衰亡期，菌數(shù)減少，pH值繼續(xù)回升，48 h時pH值到達7.8。通過以上試驗，確定了熒光假單孢菌(P.Fluorescen)BES—1菌體最佳發(fā)酵條件:溫度為28℃，pH 為7.0，裝液量為20 mL/250 mL三角瓶，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。通過對幾種工業(yè)碳源和氮源的比較并在3個水平上進行正交試驗，確定最佳培養(yǎng)基組成:可溶性淀粉10 g/L，豆餅粉15 g/L，葡萄糖 3 g/L，KH2P04 0.6 g/L，CaCO32 g/L。30 L發(fā)酵罐(裝量20 L)擴大培養(yǎng)，可使最大發(fā)酵菌數(shù)達到1.78×1010/mL。試驗中所確定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其原料來源廣泛，價格低廉，很適合農(nóng)業(yè)上應用，為熒光假單孢菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的條件。

2.4 載體滑石粉的用量對熒光假單孢菌ELS—1菌株吸附的效果

從圖4可以看出，隨著滑石粉用量的增加，Q也呈增長趨勢，L呈下降趨勢。當滑石粉用量從1 g/L增加到12/L時，Q值從2.19%增長到37.59%，此后增長緩慢;滑石粉用量從1 g/L增加到8 g/L，L值變化較大;從600 mg/g驟減到41.80 mg/g，隨著滑石粉用量的繼續(xù)增加，L值下降緩慢。當滑石粉用量為20g/L時，Q值為40.51%，L值為27.75 mg/g。

圖3 發(fā)酵罐菌體生長的曲線Fig.3Growth curve of Pseudomonas fluorescens

圖4 滑石粉的用量對吸附效果的影響Fig.4 Influence of talc powder dosage on the adsorption effect

結果表明，滑石粉對熒光假單孢菌ELS—1菌體的去除能力強，而負載能力略有減少。當載體用量為1 g/L時，負載能力有所增加。從整個吸附過程來看，滑石粉對熒光假單孢菌ELS—1菌株具有較好的吸附能力，用量的多少影響其對菌體的吸附效果。載體用量增多，可供菌體吸附的面積也相應增大，當菌體質量濃度一定時，單位質量的載體負載量下降。

2.5 菌劑中熒光假單孢菌ELS—1菌的活菌數(shù)

從表1可以看出熒光假單孢菌ELS—1菌體在兩種菌劑中的存活數(shù)量隨時間延長有明顯差異。保存2d以滑石粉為載體的菌劑中菌體數(shù)目均保持在1011數(shù)量級。

表1 菌劑中熒光假單孢菌ELS—1的活菌數(shù)量Tab.1 The number of living Pseudomonas fluorescens ELS—1 in the dried powder agent

2.6 ELS—1活體菌劑對油菜菌核病的溫室防治效果

溫室試驗結果，如表2所示，噴施熒光假單孢菌ELS—1菌劑50倍液和菌懸液均能有效控制油菜菌核病的發(fā)生(P＜0.05)，與不施用ELS—1菌劑和菌懸液而接種油菜菌核病病菌的對照相比，發(fā)病率分別下降了33.17%和16.17%。病指防效分別為87.85%和52.14%。二者存在極顯著差異(P＜0.001)，這可能與載體包埋有關。載體包埋菌體后，對其具有一定的保護作用，有利維持活菌數(shù)，保證了菌體的抑菌活性。與空白對照相比，ELS—1菌劑和菌懸液對幼苗的根部有顯著地促生作用(P＜0.05)，處理組的油菜根重較不施用任何菌劑的對照分別增長了65.72%和45.29%。但對葉片數(shù)的增加影響不大。溫室試驗結果也顯示，采用菌餅接種法將油菜菌核病病菌接種到油菜葉柄基部的效果顯著，油菜菌核病發(fā)病癥狀明顯減少，且不污染土壤和周圍植物，方法便利，可用于田間試驗。

表2 熒光假單孢菌ELS—1菌劑對油菜菌核病的溫室防治效果及幼苗生長的影響Tab.2 Influence of Sclerotinia sclerotiorum ELS—1 on greenhouse control effect and seedling growth

3 討論

(1)熒光假單孢菌是一種常見的菌根促生細菌，其與菌根真菌有著密切的關系。1962年，Mosse就分離到AMF孢子促生菌(Pseudomonas sp)，并發(fā)現(xiàn)其有助于AMF侵染宿主。用電子顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)AMF(Gigaspora margarita)的孢子和菌絲上粘附著熒光假單孢菌及根瘤菌。

本試驗分離得到熒光假單孢菌(P.ftuorescens)ELS—1說明植物菌根上存在一定數(shù)量的菌根促生熒光假單孢菌。本研究還發(fā)現(xiàn)當 P.Fluorescens ELS—1菌液濃度為0.8×109～2.4×109cfu/mL時，可在一定程度上促進外生菌根真菌的生長，當P.fluorescens ELS—1菌液濃度大于2.4×109cfu/mL時，隨著菌液濃度的增大，對外生菌根真菌的抑制越明顯，這可能是菌根真菌與PGPR之間存在著對營養(yǎng)及生態(tài)位的競爭［10］，并可能產(chǎn)生10多種具有生防功能的次生代謝產(chǎn)物。

(2)發(fā)酵罐生產(chǎn)菌劑所使用的培養(yǎng)基的選擇對于熒光假單孢菌菌劑推廣應用極為重要，本研究確定最主要成分為可溶性淀粉10 g/L、依次是豆餅粉15 g/L、葡萄糖3 g/L、KH2P04 0.6 g/L。

(3)滑石粉作為吸附劑的研究和應用一直受到廣泛關注，目前還未見有關滑石粉吸附菌體的報道，國外有學者將滑石粉用作微生物農(nóng)藥的主要添加劑［11］。本試驗滑石粉吸附包埋菌劑中熒光假單孢菌ELS—1菌體，降低了外界不良因素對活菌體的損害，同時菌體吸附于載體上，具有一定的緩釋效果，在貯藏期內(nèi)菌體釋放率較高，菌劑中活菌數(shù)保持在1010數(shù)量級，滑石粉均屬于非金屬礦產(chǎn)，資源豐富，開采成本低。本試驗的吸附試驗研究發(fā)現(xiàn)滑石粉對生防菌菌劑中熒光假單孢菌ELS—1菌株有較好的吸附效果，片層狀的滑石粉為菌劑中熒光假單孢菌ELS—菌株提供了豐富的吸附位點。同時，這種材料的吸附作用屬于物理吸附，因此吸附是一個快速的過程，在生產(chǎn)加工過程中能縮短用時，提高效率。當振蕩溶解菌劑時，菌體也較容易從載體上釋放出來。如果在農(nóng)業(yè)防治上推廣應用，不僅有助于滑石粉市場的進一步開拓，也對環(huán)境保護和生態(tài)維護起到不可估量的作用。本試驗對菌劑載體材料的性質和菌劑的防效進行了初步研究，關于菌劑配方的優(yōu)化、貨架期的延長、田間防效的測定以及菌劑施用方式還有待深入研究。

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