丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌體外混合培養對腸道致病菌的影響

浙江大學動物科學學院 張 玲 周 琳 楊彩梅＊

浙江惠嘉生物科技有限公司 曾新福

丁酸梭菌屬于梭菌屬，是一種專性厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，其廣泛分布于土壤，也能從健康動物的腸道中分離出來。丁酸梭菌適合動物的腸道厭氧環境（呼慧娟等，2011），可以控制消化道紊亂（張曉陽等，2012），有效抑制有害菌（曹廣添等，2012）。鼠李糖乳桿菌屬于乳桿菌，具有較強的酸及膽堿耐受能力 （王玉華等，2008），有抑制有害菌的作用 （吳光偉和韓建春，2009），具有抗氧化活性，并且可以影響機體免疫功能。目前丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌均被廣泛用作飼料添加劑，本試驗研究了丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌聯合培養對產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的抑制作用，為微生物制劑聯和使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、試劑及培養基 丁酸梭菌（Clostridium butyricum，HJCB998），由浙江惠嘉生物科技有限公司提供；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus，ATCC7469)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens，ATCC13124)，均由廣東省微生物菌種保藏中心提供；大腸桿菌C83928（Escherichia coli C83928）、沙門氏菌 （Salmonella gallinarum，C79）、金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureaus，SHZ018），均由浙江大學動物科學學院研究室提供。瓊脂、氯化鈉為分析純。厭氧液體培養基、LB液體培養基、LB瓊脂培養基、強化梭菌培養基(RCM)、DRCA梭菌選擇性培養基、伊紅美藍培養基（EMB）、 乳酸細菌培養基 （MRS）、BP培養基、HE培養基、SC培養基，均購自北京陸橋生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備 厭氧培養箱、滅菌鍋、恒溫培養箱、培養皿、超凈工作臺、試管、接種環等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 丁酸梭菌活化：將凍干管保藏菌株接種于裝有梭菌液體培養基的試管中，置于厭氧培養基中37℃靜止厭氧培養48 h，取0.1 mL轉接裝有9.9 mL厭氧液體培養基的試管，厭氧靜止培養16 h。

產氣莢膜梭菌及鼠李糖乳桿菌活化：在超凈臺內，取一定量的無菌水迅速加入打開的凍干管，輕輕將菌粉混勻溶解，然后將菌液分別轉接LB斜面及厭氧液體培養基，置37℃厭氧培養48 h后，取1環菌種接種于裝有9.9 mL厭氧液體培養基的試管，厭氧靜止培養16 h。

1.2.2 培養物的制備 將活化好的0.1 mL丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌分別接種于裝有9.9 mL厭氧液體培養基的試管，丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌、產氣莢膜梭菌均于37℃厭氧靜止培養24 h，其余腸道致病菌普通培養16 h，并分別計數。

1.2.3 混合培養 取16個裝有19.9 mL厭氧液體培養基的三角瓶，將活化的菌液稀釋到104～105cfu/mL，分組混合：（1）丁酸梭菌與大腸桿菌按濃度100∶1比例混合接種到三角瓶中；（2）鼠李糖乳桿菌、大腸桿菌按濃度100∶1比例混合接種到三角瓶中；（3）丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌及大腸桿菌按濃度 100∶100∶1 比例接種至三角瓶中；（4）將等量的大腸桿菌接種于三角瓶中作為對照。隨后置厭氧培養箱中37℃恒溫靜止培養。

活菌計數方法：分別在培養的 0、4、8、12、24、36、48、72 h取各組培養物樣本，檢測試驗組與對照組中各致病菌的數量（cfu/mL），并與單獨培養進行對比。采用稀釋平板計數法，將待測菌液搖勻，每組分別取0.1 mL樣品進行10倍連續稀釋，選取適當稀釋度的菌懸液0.1 mL，分別滴加在伊紅美藍選擇性培養基平板上，每個稀釋度3個重復，置37℃培養48 h后，計算其菌數后取平均值（三個平板菌落總數/3×10×稀釋倍數）。由于丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌是嚴格厭氧菌，在有氧情況下無法長出，計數結果為準確的致病菌菌數。

丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌對產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的體外生物拮抗作用研究方法同上。選用的計數培養基分別為SC培養基、BP培養基、HE培養基。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌對沙門氏菌的體外生物拮抗作用 從圖1可以看出，培養12 h時，丁酸梭菌培養組沙門氏菌數量比沙門氏菌單獨培養有明顯下降趨勢，菌落數差別達2個數量級，24 h后菌落數差別達4～5個數量級。鼠李糖乳桿菌對沙門氏菌的抑制作用從24 h開始比較明顯，菌落數差別為1～2個數量級。丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養時，沙門氏菌菌落數從12 h開始明顯下降，24 h后菌落數差別達3～4個數量級，可見，兩種菌聯合培養對沙門氏菌的抑制無協同作用。

圖1 丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌對沙門氏菌的體外生物拮抗作用

2.2 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對金黃色葡萄球菌的體外生物拮抗作用 從圖2可以看出，丁酸梭菌可以明顯抑制金黃色葡萄球菌，從12 h開始，其菌落數比金黃色葡萄球菌單獨培養時下降2～4個數量級；鼠李糖乳桿菌對金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用；丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養時，從12 h開始，金黃色葡萄球菌菌落數下降2～3個數量級，兩菌株混合培養對金黃色葡萄球菌的抑制無協同作用。

圖2 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對金黃色葡萄球菌的體外生物拮抗作用

2.3 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對產氣莢膜梭菌的體外生物拮抗作用 從圖3可以看出，丁酸梭菌對產氣莢膜梭菌抑制作用明顯，從8 h開始，可使菌落數下降2～5個數量級，在36 h時抑菌效果最明顯；鼠李糖乳桿菌單獨作用于產氣莢膜梭菌時，從12 h開始，可使其菌落數下降2個數量級以上；兩菌株聯合培養對產氣莢膜梭菌的抑制作用在24～48 h時低于丁酸梭菌單獨培養，其他時間無顯著差異。

圖3 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對產氣莢膜梭菌的體外生物拮抗作用

2.4 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌的體外生物拮抗作用 從圖4可以看出，丁酸梭菌能明顯抑制大腸桿菌，從8 h開始，其菌落數比大腸桿菌單獨培養時低3～4個數量級；鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌無明顯抑制作用；丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養時，可以使大腸桿菌菌落數降低3～4個數量級，并且抑菌曲線和丁酸梭菌大體一致，表明兩菌株混合培養對大腸桿菌的抑制無協同作用。

圖4 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌的體外生物拮抗作用

3 討論

丁酸梭菌是腸道正常微生物，可以調節腸道菌群，抑制腸道有害菌。研究表明，丁酸梭菌可以對大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌均產生抑制作 用 （曹 廣 添 等 ，2012；Yang 等 ，2012；Cao 等 ，2012），降低產氣莢膜梭菌在微生物群體中的比例（Kong等，2011）。丁酸梭菌可以產生有機酸降低腸道pH從而抑制有害菌的生長 (張曉陽等，2012)，同時丁酸梭菌及其脂磷壁酸也可以抑制有害菌在細胞上的附著（Gao等，2012），另外丁酸梭菌可以減輕艱難梭菌毒素蛋白的毒力并且降低該菌的數量（Woo等，2011）。本試驗表明，丁酸梭菌對產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的生長均有明顯的抑制作用。已有研究表明丁酸梭菌通過產生丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸，產生細菌素，以及對營養物質黏附位點的競爭等途徑來抑制有害菌（張曉陽等，2012；Gao 等，2012）。

鼠李糖乳桿菌具有很好的黏附性和抑菌性。Mack等（1999）研究表明，鼠李糖乳桿菌可以體外抑制大腸桿菌，除此之外，鼠李糖乳桿菌對志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、雞白痢沙門菌、腸桿菌、腸球菌等有害菌均有一定的抑制作用（劉冬梅等，2005；魏華等，2001）。 劉冬梅等（2006）研究表明，鼠李糖乳桿菌可以有效抑制有害菌，其抑菌原因主要是產生了乳酸，改變了腸道酸性環境，對有害菌產生抑制作用。本試驗表明，鼠李糖乳桿菌可顯著抑制沙門氏菌和產氣莢膜梭菌，而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無明顯抑制作用，這與之前研究結果略有不同，其原因有待進一步研究。

隨著益生菌制劑在畜牧生產中的大量應用，單一益生菌應用效果的局限性也慢慢表現出來，因此幾種益生菌的聯合發酵和聯合使用成為益生菌制劑發展的新趨勢 （馮樹和張忠澤，1990）。Stadie等（2013）研究表明，乳酸菌與酵母菌混合培養，酵母菌釋放精氨酸有助于乳酸菌生長。雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌混合培養時可加快產酸，雙歧桿菌可促進嗜酸乳桿菌增殖（張香美等，1999）。丁酸梭菌、腸膜芽孢桿菌、糞腸球菌三種菌的無細胞上清液彼此之間均有促進生長作用 （薛勝平等，2008）。丁酸梭菌與雙歧桿菌體外共培養可以明顯抑制大腸埃希桿菌O157、痢疾桿菌F2a、傷寒桿菌、艱難梭菌及產氣莢膜梭菌的生長（呂存女等，2011a、b）。丁酸梭菌和嬰兒型雙歧桿菌對霍亂孤菌有拮抗作用，并且其主要拮抗作用是由丁酸梭菌引起的（陸儉等，2000）。本試驗結果也表明，丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌聯合培養時對產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均顯示出較強的生物拮抗作用，其中起主要作用的是丁酸梭菌。

4 結論

本試驗結果表明，丁酸梭菌對產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的生長均有明顯的抑制作用；鼠李糖乳桿菌可抑制沙門氏菌和產氣莢膜梭菌，而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無明顯抑制作用；丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌聯合培養時對產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均顯示出較強的生物拮抗作用，但未表現出協同作用。

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