早產兒視網膜病變小鼠模型視網膜PEDF的表達和血清PEDF水平的變化及其意義

張梅虹 章學英 杜鵑

（復旦大學附屬金山醫院兒科，上海 201508）

早產兒視網膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）是一種增殖性視網膜病變，是兒童致盲的主要眼病之一。目前研究［1］認為，ROP是由于早產兒視網膜發育不全及病理性新生血管形成所致。血管新生是血管生成刺激因素和血管生成抑制因素相互作用的結果。色素上皮衍生因子（pigment epi－thelium derived factor，PEDF）是目前已知的天然存在于眼內的最強新生血管抑制因子，它能拮抗多種促血管生長因子，有效抑制視網膜新生血管的生長，而不干擾視網膜血管的正常發育［2］。本實驗通過觀察高氧誘導的ROP小鼠模型視網膜PEDF的表達及血清PEDF水平的變化，探討PEDF在ROP小鼠模型不同階段中的作用，為臨床研究ROP提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇7日齡健康C57BL／6J新生小鼠112只，雌雄不拘，新生小鼠未斷奶，與哺乳母鼠一同飼養，平均每窩6只。C57BL／6J新生小鼠為清潔級動物，由上海必凱實驗動物有限公司提供。將新生小鼠按照隨機數字表隨機分為模型組（n＝56）與對照組（n＝56）。模型組新生小鼠于生后第7天與哺乳母鼠一起置于密閉氧箱內飼養，氧箱一端為進氣孔，接入濕化的氧氣和氮氣的混合氣體，氧氣流量3～4 L／min，氮氣流量0.5～1 L／min；另一端為出氣孔，氧箱頂端有測氧孔，連接氧氣分析儀（美國Ceramatec公司生產，型號：OM－25AE），每天監測氧濃度5次，使氧箱內氧濃度維持在（75±2）%，控制室溫在（23±2）℃，日光照明。每2 d打開氧箱更換母鼠、墊料，添加飼料和水。在高氧環境中飼養5 d，于生后第12天返回到空氣環境中與母鼠共同飼養。對照組新生小鼠和哺乳母鼠一起在（23±2）℃環境中飼養。

1.2 視網膜鋪片的制作（ADP酶組織化學法） 2組分別取生后第12、14、17天新生小鼠各3只（6只眼），腹腔內注射氯胺酮40～50 mg／kg麻醉，4%多聚甲醛溶液左心室灌注后，立即摘取眼球并將其固定于4%多聚甲醛溶液中，4℃過夜。解剖顯微鏡下沿角膜緣后約1 mm處環行剪開，去除角膜、晶狀體、玻璃體、鞏膜、脈絡膜，以視乳頭為中心作4～5個放射狀切口；用0.05 mol／L的Tris－馬來酸緩沖液（pH7.2）漂洗；37℃反應液中孵育15 min［反應液：濃度0.2 mol／L的Tris－馬來酸緩沖液（pH7.2）中加入3 mmol／L硝酸鉛、6 mmol／L氯化鎂、1 mg／mL ADP，ADP由美國Sigma公司提供］；漂洗后用10%硫化銨顯色，甘油明膠封片。在光學顯微鏡下觀察視網膜血管發育及增生的情況。

1.3 視網膜冷凍切片的制作 2組分別取生后第12、17、22天新生小鼠各5只（10只眼），氯胺酮麻醉，4%多聚甲醛灌注后摘取眼球，剪去角膜和前房，除去玻璃體，將剩下的眼球壁標本放入4%多聚甲醛中固定1 h；用0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗標本后置于30%蔗糖中，4℃過夜。吸去標本上液體，浸入OCT液中，在－20℃冷凍切片機上，做與視神經矢狀軸平行的厚6μm的連續切片，選取切片時避開視乳頭周圍。

1.4 視網膜新生血管內皮細胞核計數 2組分別取生后第12、17、22天新生小鼠各5只（10只眼），每只眼球每間隔30μm（5張）取1張切片，共取10張切片，HE染色，在光學顯微鏡下計數每張切片上突破視網膜內界膜并與內界膜有緊密聯系的新生血管內皮細胞核的數目，計算平均每只眼球每張切片的內皮細胞核數目。

1.5 免疫組化法檢測視網膜PEDF的表達 2組分別取生后第12、17、22天新生小鼠各5只（10只眼），每只眼球每間隔30μm（5張）取1張切片，共取10張切片，按試劑盒要求進行免疫組化操作。一抗：兔抗小鼠PEDF多克隆抗體，1∶100稀釋，由美國ADL公司提供；二抗（即用型）：二步法羊抗兔IgG［辣根過氧化物酶（HRP）］，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。以切片中見棕黃色顆粒（DBA染色）為陽性。PEDF表達強度判斷：以細胞漿著棕褐黃色顆粒為陽性細胞，在高倍顯微鏡（×400）下隨機選取10個視野，計數每個高倍鏡視野的細胞數及陽性細胞數，計算平均每只眼球每張切片的陽性細胞百分率。

1.6 血清PEDF檢測 2組分別取生后第7、12、17、22天新生小鼠各8只，用摘除眼球法采血（0.3～0.5）mL，靜置30 min，3000 r／min離心10 min，分離血清，－20℃保存。血清PEDF采用雙抗體夾心 ABC－酶聯免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測。操作方法按照試劑盒說明書。試劑盒由上海森雄科技實業有限公司提供（一抗由美國ADL公司生產）。

1.7 統計學處理 采用STATA7.0統計分析軟件進行統計學分析。計量資料結果以均數±標準差（）表示，2組間結果的比較采用非配對t檢驗，多組間結果的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 視網膜新生血管形態學及定量觀察

2.1.1 視網膜新生血管形態學觀察 與對照組比較，模型組小鼠在生后第12天（出氧箱當天），視網膜血管管徑變細、分支減少、走行僵直，中央部視網膜可見大片無灌注區，周邊部視網膜仍可見部分小血管結構；在生后第14天（出氧箱后2 d），視網膜血管明顯擴張、迂曲，在視網膜灌注區和無灌注區交界的視網膜中周部開始出現少量新生血管；在生后第17天（出氧箱后5 d）視網膜血管更加擴張、迂曲，大量的新生血管形成，血管網結構及分布極其紊亂，可見新生血管叢、微血管瘤及滲出。見圖1。

2.1.2 視網膜新生血管的定量觀察 對照組小鼠視網膜未見或極少見突破內界膜的血管內皮細胞核。模型組小鼠在生后第17天和第22天時可見較多突破內界膜長入玻璃體的血管內皮細胞核，單獨或成簇出現，與對照組同時點以及同組第12天比較，差異有統計學意義（P＜0.01和0.05）。見表1、圖2。

圖1 新生小鼠視網膜血管鋪片（A：×40，B：×400，ADP酶組織化學染色）

表1 新生小鼠視網膜不同時點突破內界膜的血管內皮細胞核計數（）

表1 新生小鼠視網膜不同時點突破內界膜的血管內皮細胞核計數（）

注：與同組生后第12天比較，＊P＜0.05

組別 n 眼 生后第12天 生后第17天 生后第22天 F值 P值模型組 5 10 0.7±1.1 69.4±9.3＊ 76.0±8.4＊ 332.86 0.000對照組 5 10 0.9±1.0 1.5±1.2 1.3±1.1 0.34 0.713 t值 －0.39 24.26 27.58 P值 0.705 0.000 0.000

圖2 模型組新生小鼠生后第17天視網膜組織切片（×400，HE染色）

2.2 不同時點視網膜PEDF的表達 新生小鼠PEDF蛋白陽性表達產物呈棕黃色。見圖3。對照組小鼠視網膜PEDF蛋白在生后第12天時開始略有表達，第17天時視網膜各層均可見陽性表達，第22天時維持高表達，第17天和第22天時均高于第12天時，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組生后第12天時PEDF陽性細胞百分率顯著高于對照組，第17天時則顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

圖3 模型組新生小鼠生后第12天視網膜PEDF的表達（×100，DBA染色）

2.3 血清PEDF水平的變化 對照組小鼠血清PEDF水平隨日齡的增大而呈波動性變化：生后第7天和第12天時PEDF水平較低，第17天時增高（P＜0.05），第22天時又降至較低水平。模型組小鼠血清PEDF水平較低，生后第17天低于對照組（P＜0.05），生后第22天顯著低于對照組（P＜0.01）。見表3。

表2 2組新生小鼠不同時點視網膜PEDF蛋白的表達（，%）

表2 2組新生小鼠不同時點視網膜PEDF蛋白的表達（，%）

注：與同組生后第17天比較，＊P＜0.05；與同組生后第12天比較，△P＜0.05

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表3 不同時間點血清PEDF水平（，ng／L）

表3 不同時間點血清PEDF水平（，ng／L）

注：與同組生后第17天比較，＊P＜0.05

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3 討 論

C57BL／6J小鼠視網膜血管在生后第7天開始發育，此時視網膜血管發育最接近人類早產兒視網膜血管的特點；而小鼠視網膜血管至第21天發育成熟時，則相當于人類胎兒孕4～5個月時的表現，因此本研究利用高氧后的相對低氧條件制作小鼠ROP模型。本研究應用ADP酶法制作的視網膜鋪片，可清晰顯示視網膜淺層、深層及新生血管的分布和形態。在高氧環境中，模型組小鼠視網膜血管發育停止；相對低氧后，中央部視網膜出現大片無灌注區，中周部的灌注區與無灌注區交界處有新生血管形成，生后第17天時達到高峰。通過對突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核計數，可對視網膜新生血管進行定量觀察，模型組小鼠生后第17天和第22天時突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核計數顯著多于對照組。模型組眼部血管改變與ROP的視網膜病變相似，ROP動物模型建立成功。

PEDF是一種多功能的糖蛋白，在人體和人眼組織中廣泛分布，其具有多種生物學活性，是天然存在于眼內的血管生長抑制劑，可抑制包括血管內皮生 長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）在內的多種血管生成誘導物的活性。本研究中，模型組小鼠在生后第12天時，視網膜PEDF蛋白過度表達，在一定程度上抑制了小鼠視網膜血管的正常發育，從而導致視網膜組織缺血缺氧；在生后第17天、第22天時，模型組小鼠視網膜PEDF蛋白表達顯著降低，而此期視網膜血管的增生也處于活躍期，其原因可能有兩方面：一方面當PEDF蛋白表達減少時，其對視網膜血管增生的抑制作用大大減弱，另一方面由于視網膜組織缺血缺氧可誘導VEGF的過度表達，從而促進視網膜血管的增生，導致 ROP的發生［4］。

本研究還顯示，ROP模型組小鼠血清PEDF水平的變化趨勢與對照組相似，但整體水平較低，于生后第17天、第22天時ROP模型組小鼠血清PEDF水平低于對照組，而此期ROP模型組小鼠視網膜新生血管數也增多，提示血清PEDF水平的下降與視網膜新生血管的形成具有一定的相關性。但是，從本研究結果來看，模型組小鼠視網膜新生血管第17天時較第12天時增多，而ROP組血清PEDF水平生后第22天時才較第12天時降低，提示血清PEDF的降低在時相上滯后于視網膜血管的增生，因此對可能發生ROP的高危兒動態監測血清PEDF水平并不能更早地預測ROP的發生。

本研究已證實PEDF在ROP的發生發展中起著重要的作用，但是如何早期發現和早期干預PEDF的異常表達從而預防ROP的發生還需要更深入的研究。

［1］ Smith LE.IGF－1 and retinopathy of prematurity in the preterm infant［J］.Biol Neonate，2005，88（3）：237－244.

［2］ 孔怡淳，韓梅，趙堪興.高氧誘導小鼠視網膜病變模型中血管內皮生長因子和色素上皮衍生因子的表達及意義［J］.中華眼科雜志，2008，44（8）：734－740.

［3］ Matsuoka M，Ogata N，Otsuji T，et al.Expression of pigment epithelium derived factor and vascular endothelial growth factor in choroidal neovascular membranes and polypoidal choroidal vasculopathy［J］.Br J Ophthalmol，2004，88（6）：809－815.

［4］ 劉欣，王偉，王安茹，等.血氧濃度波動致新生大鼠增生性視網膜病變的機制研究［J］.中華兒科雜志，2007，45（1）：7－13.