氫氧化鋁干粉與凝膠制作大鼠哮喘模型的效果比較

董 峰，唐紅衛，吳小利，向代軍，蘭曉梅，徐 菡，王成彬

解放軍總醫院 臨檢科，北京 100853

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應性、可逆性氣流受限，晚期還可出現氣道重塑。目前，全球范圍內哮喘發病率及病死率逐年上升，但至今對其發病機制仍不十分清楚。鑒于人體實驗的局限性及體外模型與體內模型的巨大差異，科學家廣泛借助于動物模型來研究哮喘。近年來，關于大鼠和小鼠過敏性哮喘模型的報道日益增多，一些文章[1-2]報道了利用氫氧化鋁干粉制作大鼠過敏性哮喘模型進行哮喘研究，另一些文章[3-4]報道了利用氫氧化鋁凝膠制作大鼠哮喘模型進行哮喘研究，但目前尚無關于氫氧化鋁干粉與凝膠制作大鼠哮喘模型效果差異的報道。本文結合目前開展的研究工作，分別用佐劑氫氧化鋁干粉、氫氧化鋁凝膠制作大鼠哮喘模型，比較兩種類型佐劑的造模效果。

材料和方法

1 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質量(250±20) g，由解放軍總醫院動物實驗中心提供，合格證書號：SCXK(京)2006-0009。

2 試劑與儀器 卵清蛋白(Grade V，Sigma公司)；氫氧化鋁干粉(Sigma公司)；滅活百日咳桿菌(天壇生物公司)；大鼠IFN-γ、IL-4檢測試劑盒(達科為公司)；高效組織細胞裂解液(索萊寶公司)。顯微鏡(Olympus公司)；酶標儀(Awareness公司)；離心機(Thermofisher公司)。

3 實驗動物分組 30只Wistar大鼠隨機分為3組，每組10只。分別為A正常對照組，B氫氧化鋁凝膠造模組，C氫氧化鋁干粉造模組。動物飼養及實驗操作均在標準清潔級動物實驗室內完成，室溫20~25℃，12 h光照/黑暗周期。動物自由飲水攝食。

4 模型制備 致敏參照文獻[5]方法進行。B組：于第1天、第8天在每只大鼠皮下多點注射OVA懸液(含1 mg OVA和200 mg Al(OH)3凝膠)，同時腹腔注射滅活百日咳桿菌6×109個；第15天起氣道內滴入0.75%的OVA 200μl，1次/d，連續4 d激發。C組：于第1天、第8天在每只大鼠皮下多點注射OVA懸液(含1 mg OVA和200 mg AL(OH)3干粉)，同時腹腔注射滅活百日咳桿菌6×109個；第15天起氣道內滴入0.75%的OVA 200μl，1次/d，連續4 d激發。A組：以0.9%氯化鈉溶液(normal saline，NS)為替代品進行上述操作。

5 大鼠行為學觀察 激發后觀察大鼠是否出現呼吸急促、喘息、口唇紫紺、扭體、躁動或行動遲緩等表現。

6 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)采集及BALF中炎癥細胞計數 最后1次激發結束24 h后，水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血致死后，迅速開胸行支氣管肺泡灌洗；BALF 1 000 r/min離心10 min，棄上清，立即加入1 ml NS重懸細胞沉淀、充池、計數。另取0.1 ml細胞重懸液涂片，瑞氏染色，分類計數嗜酸細胞百分比。

7 肺組織病理學 灌洗結束后，分離大鼠右肺組織，置于4%多聚甲醛中固定，制作病理切片，用于HE染色和PAS染色。

8 肺組織勻漿細胞因子含量檢測 取大鼠肺組織約100 mg，NS漂洗、除去血液、濾紙拭干后稱重，加入組織塊重量9倍的RIPA，制成10%的肺組織勻漿。將制備好的肺組織勻漿3 000 r/min離心15 min，取上清檢測IFN-γ、IL-4的含量，具體操作依據試劑盒說明書進行。

9 統計學處理 實驗結果以-x±s表示，以SPSS17.0統計軟件處理。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠行為學觀察 B組第1次激發后可見呼吸加深加快、點頭運動、腹肌收縮等喘息癥狀，及抓撓口鼻、口唇紫紺、扭體表現；C組第3次激發后也可見上述表現；A組無上述癥狀。

2 BALF中細胞計數和嗜酸細胞百分比 B組、C組BALF細胞計數與A組相比顯著增高(P＜0.05)；B組BALF細胞計數高于C組(P＜0.05)。同時，B組嗜酸細胞百分比高于A組和C組(P＜0.05)。見表1。

表1 灌洗液中細胞計數結果及嗜酸細胞百分比Tab.1 Cells and percentage of eosinophils in BALF

3 肺組織中細胞因子含量 與A組[(1 314.8±170.46)pg/ml]相比，B組[(929.1±172.07)pg/ml]和C 組 [(1 066±116.99)pg/ml]中 IFN-γ 含 量 顯 著降低(P＜0.01)。A組與B組大鼠肺組織勻漿中IFN-γ含量無統計學差異。另外，所選試劑盒未能檢測出大鼠10%肺組織勻漿標本中IL-4含量。

4 肺組織病理學 HE染色：C組與A組相比，見氣道及血管周圍炎癥細胞浸潤，嗜酸細胞有增多(圖1，C與A)；B組與A組相比，見氣道上皮損傷，結構紊亂，支氣管及血管周圍大量炎癥細胞浸潤，嗜酸細胞顯著增多，并浸潤各層(圖1，B與A)。PAS染色：與A組相比， B組杯狀細胞明顯增生(圖2，B與A)，C組可見杯狀細胞增生(圖2，C與A)。

討 論

大鼠及小鼠是常用的哮喘模型動物，最常用的造模方法是使用OVA對動物進行致敏和激發，以復制哮喘氣道炎癥反應過程。通常在OVA致敏環節中使用佐劑以使免疫系統產生預期的反應類型。常用的佐劑有滅活的百日咳桿菌和氫氧化鋁。百日咳桿菌中的脂低聚多糖推進以Th2為主導的應答反應；文獻報道[6]用于疫苗的佐劑氫氧化鋁為不溶性膠狀沉淀，其作用原理是氫氧化鋁凝膠通過靜電與免疫原(OVA)結合，進而增加OVA的免疫原性。氫氧化鋁佐劑與OVA同時給藥，可促進Th2表型[7]。致敏結束后，通常會通過霧化、滴鼻或氣道內滴入的途徑給予一定劑量的OVA以誘發哮喘發作。在本實驗哮喘模型的制作過程中，B組與C組均采用了相同的操作、相同的致敏原(OVA)及滅活百日咳桿菌佐劑，唯一的區別在于氫氧化鋁干粉佐劑與氫氧化鋁凝膠佐劑，因此我們推斷：佐劑的不同導致了造模效果的差異。

哮喘模型成功與否可以根據實驗鼠哮喘發作的癥狀作出初步判斷。在本次試驗中，第1次激發結束后觀察到B組大鼠出現了不同程度的呼吸急促、喘息、口唇及耳紫紺等，C組大鼠在第3次激發結束后也觀察到了上述癥狀。

過敏性哮喘的典型特征是氣道炎癥細胞浸潤，尤其是嗜酸性粒細胞增多。在BALF炎癥細胞計數及嗜酸細胞百分比這一指標中，B組與C組顯著高于A組，并且B組計數結果顯著高于C組，這一結果證明B組氣道炎癥細胞浸潤更為嚴重。除氣道炎癥細胞浸潤外，哮喘反復發作還可使氣道壁結構發生變化，在HE染色病理切片中，可見B組支氣管及血管周圍密集各種炎癥細胞，包括淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸細胞，其中以嗜酸細胞大量浸潤最為特異，另外還可見氣道黏膜不規則增生，皺褶減少，上皮細胞有不同程度的壞死、脫落。在PAS染色的病理切片中，可見B組杯狀細胞顯著增生、黏液分泌增多。C組肺組織病理切片也可見上述表現，但C組病理改變明顯輕于B組。過敏性哮喘中存在Th1/Th2平衡紊亂。與A組相比，B組與C組大鼠肺組織勻漿中Th1細胞因子IFN-γ顯著降低，體現了哮喘病理狀態下Th1功能降低的特征。

以上指標均證明大鼠哮喘模型制作成功，同時也體現了氫氧化鋁干粉造模與凝膠造模的差異。作為同一物質的兩種不同形態，氫氧化鋁凝膠為膠體懸濁液，氫氧化鋁干粉為白色粉末狀物質，不溶于水。田代印等[8]在實驗中發現氫氧化鋁干粉與OVA不能很好混合，放置后出現明顯分層，作者在實驗中也發現了同樣的問題。相關研究報道[9]佐劑與抗原混合的程度會對抗原的免疫原性產生一定影響。根據本實驗結果，我們推斷：在哮喘造模中，氫氧化鋁凝膠增強OVA所致的過敏反應的效果優于氫氧化鋁干粉。

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