缺氧誘導因子2α基因敲除對小鼠動脈粥樣硬化發生的影響

陳 倩，張 明，王海軍，丁 宇

1解放軍總醫院 南樓心血管一科，北京 100853；2上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 肝外科，上海 200127

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種心腦血管事件形成的病理學基礎，其發生的原因和機制一直是醫學領域內的重要研究課題。近年來研究發現缺氧在AS的發生發展過程中扮演了十分重要的角色[1-4]。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)是機體缺氧應答機制的核心效應分子，其中HIF-2α與血管內皮細胞功能、炎性反應以及脂質代謝的關系最為密切[5]。本實驗擬通過建立HIF-2α基因敲除小鼠模型，通過高脂飼料喂養，了解HIF-2α基因對動脈粥樣硬化病變形成的影響。

資料和方法

1 實驗動物 HIF-2α-LoxP標記小鼠(JAXMICE：008407)和Mx-Cre轉基因小鼠(JAXMICE：003556)從美國Jackson實驗室引進。ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有研究均采用雄鼠，8~12周齡，體質量20~28 g。

2 建立HIF-2α基因敲除小鼠模型 HIF-2α-LoxP標記小鼠和Mx-Cre轉基因小鼠交配后，經過兩次傳代和基因型鑒定篩選，獲得Mx-Cre陽性且HIF-2α純合LoxP標記小鼠。對這種小鼠進行連續3次腹腔注射聚肌胞，每4 d 1次，通過誘導干擾素產生后即可獲得全身HIF-2α基因敲除(HIF-2α-/-)小鼠[6]。小鼠基因型鑒定采用鼠尾標本的普通PCR鑒定,確認目的基因敲除則采用HIF-α激活劑DMOG 8mg腹腔注射3h后肝組織標本的HIF-2α免疫印跡分析。Mx-Cre陰性HIF-2α純合LoxP標記小鼠為野生型對照小鼠。

3 分組及方法 同齡HIF-2α-/-小鼠、野生型小鼠及ApoE-/-小鼠每組6只，進行高脂高膽固醇飼料喂養8周。高脂飼料(0.15%膽固醇、 25%豬油、5%糖、85%基礎飼料)購自中國醫學科學院實驗動物研究所。所有實驗動物8周后取主動脈10%甲醛固定，石蠟包埋，進行常規HE染色，觀察主動脈粥樣硬化病變情況。

結 果

1 HIF-2α基因敲除鼠的鑒定 經過雜交、篩選及聚肌胞注射誘導后成功建立HIF-2α基因敲除小鼠模型，見圖1。

2 主動脈內膜病變 經高脂飼料喂養8周后，主動脈的HE染色結果顯示，ApoE-/-小鼠可見AS病變，野生型小鼠主動脈可見輕度內膜增生，HIF-2α-/-小鼠未見明顯內膜增生(見圖2、3、4)，提示HIF-2α基因敲除對小鼠AS病變的形成有抑制作用。

討 論

缺氧誘導因子(HIF)是機體缺氧應答機制的核心效應分子，由α亞基和β亞基組成具有轉錄活性的異源二聚體。其中α亞基嚴格受到氧氣濃度調控，是HIF的調節亞基，而β亞基則持續性表達。因此，對HIF的研究主要集中在HIF-α。哺乳動物共存在三種HIF-α亞基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)，HIF-1α最早被發現，目前研究較為成熟的是在腫瘤領域。AS與腫瘤在某些方面有相似的病理生理過程，缺氧時HIF-1α和HIF-2α促進血管內皮生長因子(VEGF)等多種血管生成因子表達，促進生理性及病理性微血管生成，管壁內形成的大量微血管使得管壁進一步狹窄。由于形成的微血管為非功能性血管，管腔缺血缺氧進一步加重，形成惡性循環，使得AS進一步發展[7-8]。HIF-2α是血管組織有效適應缺氧環境的關鍵性反應因子，對于缺血缺氧及再灌注條件下保護血管內皮細胞免于細胞凋亡、保持正常功能有著至關重要的作用。HIF-2α的靶基因涉及到血管生長、收縮和舒張，骨髓造血、能量代謝、兒茶酚胺合成和鐵代謝等方面，與HIF-1α相比，HIF-2α明顯在炎性細胞表達、巨噬細胞遷移方面更為重要，在維持機體脂肪酸代謝平衡中HIF-2α起到主要調控作用[5,9]。

由于HIF-2α基因對胚胎發育至關重要，采用常規全基因敲除方法會導致小鼠在胚胎期死亡，無法得到HIF-2α基因敲除的成年小鼠實施研究，因此針對HIF-2α實施基因敲除必須采用Cre/LoxP方法。Cre重組酶是整合酶家族的一員，LoxP則是一段長34bp的回文DNA片段。Cre/LoxP系統一個最重要的特點是在Cre重組酶作用下兩個LoxP位點間能發生重組，當兩個LoxP反向時，使LoxP間的外源基因反向連接。當同向時，Cre重組酶剪切LoxP間的外源片段，并保留后邊一個LoxP位點，從而實現目的基因的條件性敲除[10]。

ApoE-/-小鼠于1992年問世，無論正常或高脂飲食均可形成嚴重的高脂血癥并自發形成纖維斑塊和復合斑塊，斑塊分布與人類AS斑塊的分布極為相似，是研究AS的經典常用模型，在本研究中作為陽性對照小鼠。結果顯示，經過相同條件下的高脂喂養8周，ApoE-/-小鼠主動脈呈現典型的AS樣改變，野生型小鼠主動脈內膜呈不同程度的增生，而HIF-2α-/-小鼠的主動脈未見內膜增生，提示HIF-2α基因敲除可抑制小鼠AS病變的形成，針對HIF-2α基因的治療可能成為AS治療策略中的一個重要手段，其作用機制還有待進一步研究。

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