重組人干擾素α1b空間誘變菌種初步篩選研究

王俊鋒，劉金毅，方向群，徐 晨，郭英華，劉桂東，常 德，陸小冬，劉長庭

1解放軍總醫院 南樓呼吸科，北京 100853；2北京三元基因工程有限公司，北京 102600

空間環境存在著微重力、強輻射、高能粒子、交變磁場等多種獨特的作用，可以使生物發生一些基因變異。利用空間環境對質粒上帶有目標表型結構基因的基因工程菌進行太空誘變，可獲得產量高或者具有新性狀的突變菌株，從而提高生物制劑的產量[1-3]。本研究利用“神舟八號”飛船對表達重組人干擾素α1b的基因工程菌株進行空間誘變，返回地面后篩選高表達目的產物的生物工程菌菌株。

材料和方法

1 菌株 重組人干擾素α1b菌種由北京三元基因工程有限公司提供。

2 培養基 LB(luria bertani)培養基：0.5%(w/v)酵母提取物(yeast extract)，1%(w/v)胰蛋白胨(tryptone)，1%(w/v)氯化鈉(NaCl)，雙蒸水補足體積。若配制固體培養基，則再加入1.5%~2%的瓊脂，充分攪拌溶解，121℃滅菌20 min。氨卞青霉素培養基(LB-Amp)：待LB培養基冷卻到50~60℃，加入100 mg/ml Amp 0.1%混勻。

3 菌種實驗衛星搭載 重組人干擾素α1b菌種搭載“神舟八號”飛船。該飛船于2011年11月1日發射，11月17日返回地面，在軌運行398 h，全程運行1 100萬公里。

4 菌種篩選 首先進行平板分離：取250μl IFNα1b-2L1A菌液接種于裝有750μl 0.9%氯化鈉注射液的試管中，混勻；再取100μl稀釋后的菌液接種于裝有900μl 0.9%氯化鈉注射液的試管中，依次稀釋至第5管，取100μl涂布于LB平板，37℃靜止培養12~20 h。抗性平板初篩：用滅菌槍頭挑取平板上不同大小的菌落單克隆，接入含有LB-Amp的平板，每板接種50個單克隆，共接種6板(共計300個單克隆)。同時在無抗性培養基上對照接種，37℃靜止培養5~7 h。試管復篩：用接種針挑取抗性平板上的單菌落，接入含有5 ml相同抗性的LB液體培養基中，37℃、180 r/min震蕩12~16 h。

5 誘導表達 首先測定每管菌液的OD600，按照OD600=1.5接種500μl菌液的比例，將相同數量的菌量接種裝有5 ml LB-Amp培養基的種子試管，37℃、180 r/min震蕩培養至OD600在0.6~0.8之間，記錄各個試管中的OD600。然后加入誘導劑IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，37℃、180 r/min震蕩誘導表達4 h。

6 目的蛋白第一輪SDS-PAGE分析 誘導結束后，取1 ml菌液離心，留取沉淀。向沉淀中加入75μl 10% SDS和75μl 8 mol/L尿素，混懸均勻后，超聲清洗儀內超聲20 min，加入50μl 4倍還原性樣品緩沖液，混勻后沸水浴10 min，離心，取5μl上清進行第一輪SDS-PAGE檢測。電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，脫色后用Line軟件分析目標蛋白的灰度及純度。分別選擇每塊膠上目的條帶灰度或純度最大的克隆，總數不超過30個克隆。

7 目的蛋白第二輪SDS-PAGE分析 對上個步驟所選擇的單克隆集中在兩塊凝膠上進行SDS-PAGE檢測，上樣量為4μl。電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，脫色后用Line軟件分析目標蛋白的灰度及純度。分別選擇每塊凝膠上目的條帶灰度或純度最大及次大的克隆，總數不超過8個。

結 果

1 抗性平板初篩 在抗性和非抗性平板均生長的陽性克隆為221株，占73.7%；僅在LB平板生長的陰性克隆數(抗性丟失)79株，占26.3%。

2 第一輪電泳分析篩選 對抗性平板初篩結果陽性克隆中編號在前的144株(克隆號1-194)進行試管復篩和誘導表達后，進行電泳檢測和軟件分析。根據IFNα1b理論分子量19.4kU以及以往經驗，按照M1或M2的分子量進行計算，以軟件分析IFNα1b條帶的灰度及純度，其中以灰度代表目的蛋白的總量，總灰度代表菌體總蛋白的量，純度代表目的蛋白占菌體總蛋白的比例。選取每次電泳15個克隆中灰度或純度最高的克隆用于下一輪檢測，灰度及純度最大值與次大值所對應的克隆號中：37、64、93是重復出現，合并后為26個克隆，即5、18、19、25、37、41、49、60、61、62、64、77、87、93、105、112、113、127、139、147、149、159、175、178、191、194。

3 第二輪電泳分析篩選 對選出的26個克隆電泳樣品集中進行SDS-PAGE并分析(見圖1)。選出4個克隆中灰度或純度最高的克隆，灰度及純度最大值與次大值所對應的克隆號中：60、127是重復出現，合并后為6個克隆，即49、60、87、93、127、191。這6個克隆的兩輪檢測結果見表1。

圖1 26個克隆的第二輪電泳圖M1為蛋白質分子量標準，自上至下分別為：94.0、66.2、45.0、33.0、26.0、20.0和14.4 kU；M2為預染蛋白質MarkⅢ，自上至下分別為：94、60、45、27、18 kU；C為重組人干擾素α1b對照品；圖下方最明顯的條帶為目的蛋白Fig. 1 Second SDS-PAGE gel images of 26 colonies M1 represents the standard protein MW from top to bottom,94.0, 66.2, 45.0, 33.0, 26.0, 20.0, and 14.4 kU. M2 is the Mark III of pre-stained proteins from top to bottom, 94, 60, 45, 27, and 18 kU. C represents the control of recombinant human INFα1b.The most obvious strip at the bottom is the target protein

表1 最后篩選到的六個克隆的兩輪檢測結果Tab. 1 Six colonies obtained after 2 time of screening

討 論

太空生物制藥是通過航天搭載來實現的[4-6]，具體來說，就是利用返回式空間飛行器，將生物制藥菌種或細胞送入太空，在地面難以模擬的太空環境下，促進菌種或細胞的生長和變異，取得地面上無法獲得的誘變效果，如利用空間環境使相對呈漂浮伸展狀態的生物染色體受到外界因素的沖擊，引起堿基的缺失、置換或插入(如引起生物DNA大分子斷裂，使雙螺旋中的氫鍵斷裂，或斷裂后再交叉聯接，或促使堿基降解)，從而改變基因內部原有的堿基及排列順序，引起表型發生改變，產生新的遺傳變異，并且在返回地面后進行培育、篩選得到生產性能優良的微生物菌種或細胞，形成規模化生產。而微生物和動植物細胞是目前藥品的主要來源，但有些藥物的地面生產能力非常有限，于是利用微生物和動植物細胞的航天搭載技術來生產出更多、性狀更好的藥物，成為航天技術應用于制藥行業的重要課題。

重組人干擾素是一種常用的藥物，在臨床上應用十分廣泛，它與細胞表面受體結合，誘導細胞產生多種抗病毒蛋白，從而抑制病毒在細胞內的復制，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖以及提高免疫功能等作用[7-10]。目前市場上的重組人干擾素價格較貴，如果提高生物工程菌的產能，其價格也會相應便宜。本研究選擇重組人干擾素α1b進行“神舟八號”搭載，返回地面后經過初步篩選獲得6株表達較高的空間誘變菌株，證實空間環境對生物工程菌的確存在誘變作用。通過空間多重因素交互作用下，產生了目的蛋白表達量不同的基因工程菌菌株。但空間誘變的具體機理還不是很清楚，空間環境中存在著微重力、強輻射、高能粒子、交變磁場等多種獨特因素，這些因素是如何作用？此次誘變過程是哪種因素占據了主導作用？均不是很清楚。另外，目前初步篩選出6株表達較高的空間誘變菌株，其表達量是否高于出發菌株？遺傳穩定性怎么樣？目的蛋白的生物學活性是否發生改變？均尚需進一步研究。

1 魏麗勤，方曉梅，李寧梅，等．太空搭載泰樂［1］魏麗勤，方曉梅，李寧梅，等．太空搭載泰樂菌素高產菌株的選育［J］.工業微生物，2007，37（1）：1-7．

2 蔣培霞，張瑞萍，王海勝，等．紫色桿菌素合成工程菌太空誘變效應及其高產菌株的篩選［J］.化工學報，2010，61（2）：455-461．

3 廖愛芳，史佳棟，付靜，等．核糖霉素高產菌株核苷鏈霉菌篩選［J］.中國抗生素雜志，2010，35（10）：739-742，778．

4 王艷芳，趙彥宏，劉林德，等．空間誘變微生物研究進展［J］.安徽農業科學，2009，37（16）：7335-7336，7342．

5 翁曼麗，李金國，高紅玉，等．大腸桿菌菌種空間變異的研究［J］.航天醫學與醫學工程，1998，11（4）：13-16．

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7 李剛．重組人干擾素α1b對小兒輪狀病毒腹瀉患者外周血T淋巴細胞亞群的影響研究［J］.現代預防醫學，2012，39（6）：1389-1390．

8 孫薇，喬逸，郭麗，等.小兒注射重組人干擾素α1b治療病毒性肺炎的耐受性及安全性［J］.中國新藥雜志，2011，20（23）：2340-2344.

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10 Masci P， Olencki T， Wood L， et al. Gene modulatory effects，pharmacokinetics， and clinical tolerance of interferon-alpha1b ： a second member of the interferon-alpha family［J］. Clin Pharmacol Ther， 2007， 81（3）： 354-361.