空間環(huán)境誘導(dǎo)褪色沙雷菌LCT-SM166的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王雅娟，劉進(jìn)文，方向群，李天志，王俊鋒，郭英華，徐國綱，常 德，蘇龍翔，姜學(xué)革，劉 巖，陳振鴻，王 立，劉長庭

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2深圳華大基因研究院，廣東深圳 518083

微生物在不同環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性變化，空間環(huán)境作為一種特殊的環(huán)境因素也會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生一定的影響。隨著人類在太空活動(dòng)的增多，航天員體內(nèi)攜帶的細(xì)菌和飛行艙內(nèi)的細(xì)菌不可避免地進(jìn)入太空，這些細(xì)菌在空間環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生怎樣的生物學(xué)變化尤其是致病性的變化一直是航天醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)。有研究表明經(jīng)航天搭載后沙門氏菌、銅綠假單胞菌的毒力均有所增加，可能對(duì)航天員的健康產(chǎn)生威脅[1-2]。此外有報(bào)道空間環(huán)境下細(xì)菌生物被膜的形成增多增厚，不僅可能增加細(xì)菌的毒力和耐藥性，也可能腐蝕航天設(shè)備[3-4]。因此研究空間環(huán)境對(duì)細(xì)菌的影響至關(guān)重要。此外空間環(huán)境相關(guān)的低剪切力也存在于體內(nèi)病原菌感染發(fā)生的環(huán)境，包括腸道、呼吸道和泌尿生殖道[5]。研究和空間環(huán)境相聯(lián)系的微重力對(duì)細(xì)菌的影響有助于更好地理解細(xì)菌感染的發(fā)生。褪色沙雷菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，是水和土壤中的常居菌群，也是臨床常見的條件致病菌，在空間站中也曾被檢出。本研究利用神州八號(hào)飛船搭載實(shí)驗(yàn)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了真正的空間環(huán)境這一實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)返回地面的褪色沙雷菌進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，以期發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境對(duì)褪色沙雷菌的影響。

材料和方法

1 材料 褪色沙雷菌購于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC 1.185 7。菌株的鑒定用LA Taq酶(Takara)、PCR儀和ABI 3730xl全自動(dòng)序列分析儀，蛋白濃度測(cè)定BCA試劑盒購自美國Thermo fish公司，同重同位素相對(duì)與絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)試劑盒購自美國ABI公司。

2 空間環(huán)境誘導(dǎo)的菌株獲得及鑒定 褪色沙雷菌經(jīng)過神州八號(hào)飛船搭載后返回地面，搭載時(shí)間398 h，分離獲得空間誘變菌株LCT-SM166，同時(shí)設(shè)地面同步溫度對(duì)照株LCT-SM213。將上述兩株已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增16S rDNA，16S rDNA PCR產(chǎn)物用96孔millpore純化系統(tǒng)純化后準(zhǔn)確定量，經(jīng)ABI 3730xl全自動(dòng)序列分析儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測(cè)序結(jié)果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1 350 bp(雙向測(cè)序)用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導(dǎo)入seqman，輸出single file(fasta)后，經(jīng)Mega 5.0軟件clusterW多重比對(duì)，輸出meg文件重新導(dǎo)入構(gòu)建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000。

3 同重同位素相對(duì)與絕對(duì)定量(ITRAQ)技術(shù)定量蛋白質(zhì) 從樣品中提取蛋白，對(duì)提取后的蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續(xù)充分酶解蛋白，用GE公司的2D quant kit法進(jìn)行蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定，等體積進(jìn)行十二烷基磺酸鈉電泳，酶解蛋白，用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段，將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合，對(duì)混合后的肽段使用強(qiáng)陽離子交換色譜(strong cation exchange choematography，SCX)進(jìn)行預(yù)分離，進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

4 蛋白質(zhì)鑒定 對(duì)質(zhì)譜下機(jī)的原始文件進(jìn)行峰識(shí)別，得到峰列表。建立參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行肽段及蛋白質(zhì)的鑒定。選擇數(shù)據(jù)庫遵循如下原則：若為已測(cè)序生物直接選用該物種數(shù)據(jù)庫，若為非測(cè)序生物選擇與被測(cè)樣品最為相關(guān)的大類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。本次數(shù)據(jù)庫是通過比對(duì)地面對(duì)照褪色沙雷菌的基因組測(cè)序注釋到的蛋白質(zhì)。建立數(shù)據(jù)庫后采用ProteinPilot進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。每種樣品重復(fù)了3次、繪制3次鑒定到的蛋白質(zhì)重疊圖，并分析肽段序列長度分布、肽段序列覆蓋度和肽段數(shù)量分布。以3次重復(fù)中有2次或以上重復(fù)鑒定到的蛋白質(zhì)為最終鑒定的蛋白質(zhì)。

5 蛋白質(zhì)定量分析 在ITRAQ定量分析中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)定量值滿足下面兩個(gè)條件時(shí)視為單次重復(fù)間的差異蛋白；在3次重復(fù)中至少2次達(dá)到以下要求視為最終的差異蛋白：1)蛋白豐度差異倍數(shù)超過1.2倍以上；2)經(jīng)多重假設(shè)檢驗(yàn)，P＜0.05。

6 蛋白質(zhì)及差異蛋白質(zhì)的注釋分析 蛋白相鄰類的聚簇(cluster of orthologous groups of proteins，COG)是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。將鑒定到的蛋白和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)這些蛋白可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。GO功能顯著性富集分析給出與所有鑒定到的蛋白質(zhì)背景相比，差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO功能條目，從而給出差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。GO功能分析包括三個(gè)方面，分別為描述基因的分子功能(molecular function)、所處的細(xì)胞位置(cellular component)、參與的生物過程(biological process)。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上，且經(jīng)多重假設(shè)檢驗(yàn)P＜0.05時(shí)，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。該分析首先把所有差異蛋白質(zhì)向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http：//www.geneontology.org)的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的蛋白質(zhì)數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與所有蛋白質(zhì)背景相比，在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO條目。以P≤0.01為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO term。

結(jié) 果

1 菌株的16S rDNA鑒定 16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長約1.5 kb。LCT-SM166和LCT-SM213的16S rDNA鑒定結(jié)果為：LCT-SM166與褪色沙雷菌的匹配率為99.776%，LCT-SM213與褪色沙雷菌的匹配率為100%。說明兩株菌均屬于褪色沙雷菌。2 蛋白質(zhì)鑒定 對(duì)空間環(huán)境誘導(dǎo)株LCT-SM166以及地面對(duì)照株LCT-SM213均進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中3次重復(fù)均鑒定到的蛋白質(zhì)有1 482個(gè)，兩次重復(fù)鑒定到的蛋白質(zhì)有231個(gè)，一共鑒定到1 713個(gè)蛋白質(zhì)。肽段序列長度占總長度5%以上的肽段氨基酸殘基數(shù)為7~15個(gè)，肽段序列覆蓋度10%以上占80%左右(圖1)，覆蓋11個(gè)肽段的蛋白數(shù)量在590以上(圖2)。

圖1 三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的肽段序列覆蓋度分布(不同顏色代表不同的序列覆蓋度范圍，餅狀圖百分比為處于不同覆蓋度范圍的蛋白數(shù)量占總蛋白數(shù)量的比例)Fig. 1 Distribution of peptide sequences in triplicate experiments

圖2 三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的肽段數(shù)量分布圖(橫坐標(biāo)為覆蓋蛋白的肽段數(shù)量范圍，縱坐標(biāo)為蛋白數(shù)量)Fig. 2 Distribution of peptides in triplicate experiments

3 蛋白質(zhì)定量分析 空間環(huán)境誘導(dǎo)株LCT-SM166經(jīng)與地面對(duì)照株LCT-SM213比較后，統(tǒng)計(jì)得到的蛋白差異數(shù)量為111個(gè)，其中上調(diào)21個(gè)，下調(diào)90個(gè)。

4 蛋白質(zhì)的COGs功能注釋 80%以上鑒定到的蛋白質(zhì)分布于能量的生成和轉(zhuǎn)換、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯過程和核糖體的結(jié)構(gòu)和生物合成、轉(zhuǎn)錄過程、細(xì)胞膜的合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等(圖3)。

圖3 COG分類不同功能的蛋白質(zhì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)量(橫坐標(biāo)為COG條目，縱坐標(biāo)為蛋白數(shù)量)Fig. 3 Proteins calculated according to the COG function classification

5 差異蛋白質(zhì)的GO功能富集分析 空間環(huán)境誘導(dǎo)株LCT-SM166與地面對(duì)照株LCT-SM213的差異蛋白質(zhì)所處的細(xì)胞位置主要在細(xì)菌外膜，其分子功能主要為翻譯因子活性和核酸結(jié)合、蘋果酸酶活性、翻譯調(diào)節(jié)活性等(表1)，其參與的生物過程主要為翻譯、細(xì)胞蛋白代謝過程、蛋白代謝過程、己糖代謝過程等(表2)。

表1 差異蛋白GO功能富集分析(分子功能)Tab. 1 Gene ontology enrichment analysis of proteins with differential expressions(molecular function)

討 論

空間自然環(huán)境具有不同于地面的一些特殊因素，包括失重、高真空、極端溫度、弱磁場(chǎng)和粒子輻射等。而航天器中產(chǎn)生的誘導(dǎo)環(huán)境則以微重力為主，是航天員生活的主要環(huán)境。空間環(huán)境對(duì)生物體影響的研究通過兩種手段，一是通過航天飛船搭載或在空間站上進(jìn)行的實(shí)際空間環(huán)境下的研究；二是在地面通過旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotary cell culture system，RCCS)、懸吊法等實(shí)施地面模擬微重力條件下的研究。既往空間環(huán)境對(duì)細(xì)菌影響的研究多集中在人類最大的常駐菌群—腸道菌群的研究。不管是航天搭載實(shí)驗(yàn)還是地面模擬實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的毒力增加，大腸桿菌在模擬微重力條件下也出現(xiàn)毒力增加的現(xiàn)象[1,6]。細(xì)菌在空間環(huán)境下發(fā)生毒力變化的機(jī)制尚不明確，通過針對(duì)沙門氏菌和銅綠假單胞菌的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)微重力可致廣泛的基因轉(zhuǎn)錄蛋白變化，在此變化基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了一種廣泛的調(diào)控蛋白Hfq，在微重力所致細(xì)菌侵襲性的增加及巨噬細(xì)胞中存活能力的提高起重要的作用[1,7-8]。因此，空間環(huán)境對(duì)細(xì)菌影響和機(jī)制的研究有待進(jìn)一步展開和深入。

表2 差異蛋白GO功能富集分析(生物過程)Tab. 2 Gene ontology enrichment analysis of proteins with differential expressions(biological process)

褪色沙雷菌所致院內(nèi)感染可見于泌尿道、呼吸系統(tǒng)、傷口感染以及菌血癥。該菌曾在空間站中被檢出，可能威脅航天員的健康。本研究利用神州八號(hào)飛船搭載褪色沙雷菌，返回地面后采用新一代的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)空間誘變菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出空間環(huán)境所致褪色沙雷菌的差異表達(dá)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)有111個(gè)蛋白發(fā)生變化，其中上調(diào)的為21個(gè)，下調(diào)的為90個(gè)。這些蛋白主要同翻譯因子活性、翻譯調(diào)控因子活性、蘋果酸酶活性有關(guān)，其參與的生物過程主要翻譯、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物代謝等。由此可見褪色沙雷菌在空間環(huán)境發(fā)生變化的蛋白質(zhì)主要與能量的代謝有關(guān)，這可能是細(xì)菌為適應(yīng)空間環(huán)境而產(chǎn)生的變化。

隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等多種組學(xué)研究的發(fā)展，貫穿組學(xué)成為生物信息學(xué)研究的新方向，貫穿組學(xué)即利用生物信息學(xué)分析方法，整合基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組、蛋白質(zhì)組乃至宏基因組等多層次的數(shù)據(jù)開展系統(tǒng)性研究。過去針對(duì)空間環(huán)境對(duì)細(xì)菌的影響的研究局限在基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白組的單個(gè)層面，或某兩個(gè)層面，本研究目前也僅涉及細(xì)菌的蛋白質(zhì)組學(xué)。下一步將結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組，利用三維立體層面，系統(tǒng)地分析細(xì)菌在空間環(huán)境中的貫穿組學(xué)變化，全面篩選調(diào)控細(xì)菌在空間環(huán)境中發(fā)生改變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，詳細(xì)解答細(xì)菌是如何感受太空環(huán)境、具體發(fā)生的變化以及如何變化等問題。

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