空間誘導蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25和LCT-BC235的蛋白質組學研究

蘇龍翔，劉進文，方向群，李天志，王俊峰，郭英華，常 德，徐國綱，劉長庭

1解放軍總醫院 南樓呼吸科，北京 100853；2南開大學醫學院，天津 370071；3深圳華大基因研究院，深圳 518083

蠟樣芽胞桿菌是革蘭氏陽性桿菌，好氧或兼性厭氧并能形成孢子，是一種條件致病菌，能產生三種不同的腸毒素，引起嘔吐綜合征和腹瀉[1-3]。宇宙空間站中普遍存在蠟狀芽孢桿菌，宇航員的食物容易受到蠟狀芽孢桿菌的污染[4]。因此研究空間誘變的蠟狀芽孢桿菌對空間駐留人員的健康具有重要意義。本研究利用神州八號飛船實驗平臺搭載蠟狀芽孢桿菌進行實際天基實驗，對返回地面后的菌株進行了蛋白質組檢測，以期發現空間環境對蠟狀芽孢桿菌的影響。

材料和方法

1 菌株選擇 蠟狀芽孢桿菌來源于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，菌株號CGMCC 1.230。將此菌株搭載神州八號飛船飛行398 h后返回地面，分離出LCT-BC25和LCT-BC235兩株空間誘變菌株。同時地面做相應溫度對照株培養，命名為LCT-BC244。經細菌分型鑒定LCT-BC244的16S rRNA基因序列與蠟狀芽孢桿菌14 579 100%相似。

2 蛋白質組檢測 根據標準定量蛋白組學的實驗方法[5]。首先從3組樣品中提取細菌蛋白質，進行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續充分酶解蛋白。用GE公司的2D quant kit法進行蛋白質濃度測定。等體積進行十二烷基磺酸鈉(SDS)電泳后進行酶解蛋白。用iTRAQ試劑標記肽段，將標記后的肽段進行等量混合，使用強陽離子交換色譜(strong cation exchange choematography，SCX)進行預分離。最后進行液相串聯質譜(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

3 生物信息分析 對于質譜下機的原始文件進行峰識別，得到峰列表。建立參考數據庫進行肽段及蛋白質鑒定。所有鑒定到的蛋白質進行COG功能分析、GO功能分析和KEGG通路分析。最后比較各蛋白在各樣品之間的相對含量，從而獲得一些感興趣的重要蛋白。本研究中當蛋白質定量值同時滿足以下條件視為最終的差異蛋白：1)進行3次重復實驗，某個蛋白至少出現在2次重復實驗中；2)蛋白豐度差異倍數＞1.2倍；3)經多重假設檢驗(multiple hypothesis testing)，其P＜ 0.05。

結 果

1 蛋白質組鑒定 3次重復實驗共得到418 896張譜圖，11 453個肽段。蛋白質數據庫匹配后得到1 501個蛋白質。取3次重復實驗中出現≥2的蛋白質作為最終鑒定到的可能蛋白質。最終得到1 269個可能蛋白質。

2 功能分析 對1 269個可能的蛋白質進行COG功能分析發現，80%以上的蛋白質分布于能量的生成和轉換、氨基酸的轉運和代謝、翻譯過程和核糖體的結構和生物合成、轉錄過程、信號轉導機制(圖1)。GO功能分析發現，大部分蛋白的功能與代謝活性和細胞學過程相關(圖2)。KEGG代謝通路分析發現，這些蛋白大都與細菌的代謝過程和次級代謝相關。

3 蛋白定量分析 兩株經空間誘變的蠟狀芽孢桿菌與地面對照株比較，差異表達蛋白的分布情況如圖3所示。該圖顯示了三次重復中蛋白定量平均值分布情況，其中橫坐標表示差異倍數經過以2為底數的對數轉化后的值。＞0的為表達量上調，＜0的為表達量下調。其中LCTBC25與地面對照株LCT-BC244比較有57個蛋白上調，77個蛋白下調；LCT-BC235與地面對照株LCT-BC244比較有8個蛋白上調，73個蛋白下調。

圖1 COG分類不同功能的蛋白質的統計數量Fig. 1 Proteins with different functions according to COG

圖2 GO功能分析各條目數量占總蛋白數量的百分比Fig. 2 Number of proteins/total number of proteins (%) according to GO

圖3 空間誘變蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25 (左)和LCT-BC235 (右)蛋白質豐度分布圖Fig. 3 Protein abundance distribution in space environment-induced LCTBC25 strain (left) and LCT-BC235 strain (right)

表1 空間誘導蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25差異表達蛋白Tab. 1 Differentially expressed proteins of space environment-induced LCT-BC25 strain

表2 空間誘導蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235差異表達蛋白Tab. 2 Differentially expressed proteins of space environment-induced LCT-BC235 strain

4 差異表達蛋白 在上述分析的基礎上，分別從LCT-BC25和LCT-BC235中篩選出最具差異的5個上調蛋白和5個下調蛋白(表1、表2)。LCTBC25和LCT-BC235差異蛋白的不同說明空間突變的不定向性。差異蛋白大都是一些代謝活性和調節相關蛋白。LCT-BC235的溶血性腸毒素高表達，提示其毒力和致病力可能增強。

討 論

既往關于微重力對細菌致病性的影響研究最多的是腸道沙門氏菌。多個研究都表明經過空間環境誘導后沙門菌的毒力增強[6-7]。此外，Chopra等[8]使用雙向凝膠電泳檢測方法來探討微重力致細菌毒力改變的機制，研究在模擬微重力條件下對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌蛋白質表達的影響。其研究發現，模擬微重力暴露后的致病性大腸桿菌，74種蛋白表達升高，18種蛋白表達不足，新表達的蛋白有62種。而對于鼠傷寒沙門氏菌則分別為35種、33種和57種。通過Northern Blot方法發現暴露于模擬微重力條件下的產毒性大腸桿菌編碼毒力因子LT-1的基因發生上調。但目前空間微生物學相關研究的研究尚處于起步階段，關于微重力致細菌毒力改變的機制仍不明確。對于同為腸內常駐菌群的蠟狀芽孢桿菌未有研究報道。對病原微生物進行蛋白組學研究有利于從分子層面揭示相關的致病機制，闡明疾病的發病機理[9]。尤其是空間極端環境能夠導致細菌的致病力和毒性發生改變，對空間飛行后的菌株進行相關研究具有重要的現實意義[10-11]。

蠟樣芽胞桿菌與少數食物中毒有關(約2%~5%)，這是由于蠟狀芽孢桿菌產生腸毒素，人食用含毒素的食物產生一系列包括嚴重的惡心、嘔吐以及腹痛腹瀉等不良反應。我們的研究發現，經過搭載神舟八號飛船空間誘變后的蠟狀芽孢桿菌大部分鑒定到的蛋白質屬于代謝相關蛋白，可見在空間環境的誘導下細菌通過自身代謝水平的調節發生對空間極端環境的適應性過程。經過空間誘變后，兩株蠟狀芽孢桿菌均出現了明顯差異表達的蛋白質，但是這兩株細菌差異表達的蛋白質譜明顯不同，說明了空間突變的不定向性。空間誘變蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25主要的差異蛋白與代謝調節水平相關；而LCT-BC235除了有代謝相關蛋白改變，還出現了溶血性腸毒素蛋白的明顯高表達，提示這株細菌可能有較強的毒力，極有可能對空間站航天員造成潛在的危害。但目前對于該溶血性腸毒素基因的相關研究較少，有待于進一步研究該基因改變的意義和相關的致病機制。

本研究是一個對空間環境下蠟狀芽孢桿菌的蛋白質組進行測序和分析的實驗研究，這為揭示蠟狀芽孢桿菌在空間的變化和毒力改變奠定了基礎，為后期我國空間站的建立和宇航員的健康提供了保障。

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2 Jensen GB， Hansen BM， Eilenberg J， et al. The hidden lifestyles of Bacillus cereus and relatives［J］. Environ Microbiol， 2003， 5（8）：631-640.

3 Kotiranta A， Lounatmaa K， Haapasalo M. Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections［J］. Microbes Infect，2000， 2（2）：189-198.

4 Novikova ND. Review of the knowledge of microbial contamination of the Russian manned spacecraft［J］. Microb Ecol， 2004， 47（2）：127-132.

5 Unwin RD， Griffiths JR， Whetton AD. Simultaneous analysis of relative protein expression levels across multiple samples using iTRAQ isobaric tags with 2D nano LC-MS/MS［J］. Nat Protoc，2010， 5（9）： 1574-1582.

6 Wilson JW， Ott CM， H?ner zu Bentrup K， et al. Space flight alters bacterial gene expression and virulence and reveals a role for global regulator Hfq［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007， 104（41）：16299-16304.

7 Nickerson CA， Ott CM， Mister SJ， et al. Microgravity as a novel environmental signal affecting Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence［J］. Infect Immun， 2000， 68（6）： 3147-3152.

8 Chopra V， Fadl AA， Sha J， et al. Alterations in the virulence potential of enteric pathogens and bacterial-host cell interactions under simulated microgravity conditions［J］. J Toxicol Environ Health A， 2006， 69（14）： 1345-1370.

9 楊彩娥，匡鐵吉．比較蛋白質組學及其在結核分枝桿菌研究中的應用［J］.軍醫進修學院學報，2007，28（5）：389-392．

10 劉長庭．空間環境對微生物的影響及意義［J］.軍醫進修學院學報，2012，33（5）：433-434．

11 劉長庭．利用空間環境服務于人類健康［J/OL］. http：//www.cnki.net/KCMS/detail/11.3275.R.20120906.1723.004.html