大黃酸對糖尿病腎病大鼠足突細胞nephrin基因表達的影響

陳建偉，劉 玲，鐘 玲

（重慶醫科大學附屬第二醫院腎內科 400010）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病嚴重的常見微血管并發癥，是最終導致終末期腎衰竭的常見原因，也是糖尿病致死的主要原因之一，由于其發病率高，治療棘手、效果差，危害大而備受關注。而近年來研究發現nephrin基因在足突細胞上的表達下調在腎功能不斷惡化中起到重要作用［1］。因此，如何抑制nephrin基因在足突細胞上的下調，在DN的治療中起到至關重要的作用，目前為止很多臨床對照研究顯示，大黃酸在控制DN蛋白尿及DN進展中有一定作用，然而，其除了對血糖、胰島素抵抗、減輕腎臟肥大等作用之外［2－3］，是否能夠抑制nephrin基因下調，目前尚無實驗研究。本實驗旨在探索大黃酸對DN的治療作用，以及通過nephrin基因在DN大鼠足突細胞的表達變化，探討大黃酸治療DN的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠18只，體質量170～200g（重慶醫科大學中心實驗室）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）［3－4］。

1.2 試劑 24h尿蛋白測定試劑盒（北京為康惠華生物公司）；酶聯免疫吸附測試大鼠尿微量清蛋白試劑盒（上海研謹生物科技有限公司）；抗體稀釋液（ADI公司）；兔抗nephrin抗體。

1.3 實驗藥物 大黃酸是從大黃的根莖中提取［5－6］，大黃根莖購自北京興事堂，并由上海眾華生物科技有限公司提取。

1.4 儀器 德國Satorious電子天平；日立7020生物分析儀。

1.5 方法

1.5.1 動物模型制作 按照Anderson等［1］建立方法將所有動物適應性喂養5d，禁食12h，STZ以0.1mmol／L檸檬酸緩沖液溶解，按照50mg／kg一次性腹腔注射作為DN模型，模型對照組給予同等劑量的檸檬酸緩沖液，72h后開始檢測空腹血糖、尿糖、尿量及24h微量清蛋白排泄率，DN建立成功標準為：（1）空腹血糖高于16.6mmol／L；（2）尿糖強陽性；（3）尿量／原尿量大于1.5；（4）24h尿蛋白排泄率大于30mg／24h。

1.5.2 實驗分組 將DN動物模型分為2組：模型組、大黃酸治療組。大黃酸溶于生理鹽水，灌胃給藥，每天1次，大黃酸治療組給予大黃酸150mg·kg－1·d－1干預8周（n＝6），模型組及模型對照組分別給予等劑量生理鹽水灌服作為對照（n＝6）。實驗重復2次。

1.5.3 血糖、體質量、腎功能的測量 每2周測量各組大鼠血糖1次；第8周測定各組大鼠體質量；股動脈放血20μL分離血清，使用日立7170A全自動生化分析儀（重慶醫科大學中心實驗室）測量血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、血清總膽固醇（TC）及三酰甘油（TG）。

1.5.4 尿微量清蛋白排泄率的檢測 給藥6周后，大鼠放入代謝籠，留取24h尿液，計算尿量，尿液離心25min（4℃，4 000r／min），取上清液分裝，并于－70℃凍存，后使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測尿蛋白。

1.5.5 腎組織形態學觀察 大體觀察并稱質量。光鏡下觀察：在給予大鼠大黃酸干預8周后，麻醉并經腹主動脈插管，5℃磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注后取腎臟。迅速剝去腎包膜，稱重后縱向剖開腎臟，切取約0.5cm×0.5cm×0.2cm大小的腎臟組織，腎組織經過10%中性甲醛緩沖溶液中固定、浸蠟、包埋、切片，HE、PAS、Masson3染色觀察，取1mm×1mm×1 mm腎皮質，經戊二醛固定、餓酸后固定、脫水、環氧樹脂618包埋，制作成超薄切片，用醋酸鈾－檸檬酸鉛染色，JEM透射電鏡下觀察。

1.5.6 腎臟免疫組織化學檢測 5μm腎組織石蠟切片梯度脫蠟水化后，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，0.01mol／L PBS緩沖液洗滌，正常兔血清封閉，一次加入nephrin抗體，DAB顯色，蘇木精復染，樹脂封片，采用JD－801計算機圖像分析系統，每張切片隨機選取15個腎小球，計算各組腎小球內nephrin的陽性信號占腎小球面積百分比［4］。

1.5.7 腎小球足突細胞密度測定 10%中性甲醛緩沖溶液固定，常規脫水、浸蠟、包埋、5μm石蠟切片。兔抗大鼠 WT1多克隆抗體（Merk公司）免疫組化SP法檢測腎小球WT1表達，Image－Pro Plus 6.0彩色圖像分析系統半定量足突細胞密度。

1.6 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以表示，兩組間比較進行t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 模型組血糖均有升高，與模型對照組比較，均有多尿、多飲、多食、消瘦等癥狀。模型制作成功后，模型組血糖較模型對照組血糖升高明顯（P＜0.05），除模型對照組外，其余兩組間血糖差異無統計學意義（P＜0.05）。DN大鼠體質量均低于模型對照組（P＜0.05）。

2.2 各組指標比較 模型組大鼠24h尿蛋白定量均高于模型對照組（P＜0.05），見圖1。6周后大黃酸治療組與模型組比較，除血糖無明顯變化外，BUN，Cr顯著改善（P＜0.05），見表1。

圖1 各組24h尿蛋白量

2.3 腎組織形態學改變 模型組腎臟較模型對照組腎臟外觀蒼白、腫脹，質地變硬。模型對照組大鼠腎小球、腎小管形態規則，無明顯細膜基質增生。模型組腎小球肥大，見系膜區彌漫性增寬，并有逐漸增多的PAS陽性物質沉積，腎小球基底膜（GBM）增厚，近端腎小管上皮細胞含較多糖原，并呈空泡樣及顆粒樣變性，間質內較多淋巴細胞等炎性細胞浸潤。大黃酸干預后，腎小球及腎小管病變均有不同程度改變。見圖2。

表1 各組生化數據變化比較

表1 各組生化數據變化比較

組別 n 體質量（g） 腎質量（g） 血糖（mmol／L） BUN（mmol／L） Cr（μmol／L） TC（mmol／L） TG（mmol／L）模型對照組 6 412.1±13.1 2.07±0.12 5.10±0.11 5.90±0.68 71.2±0.58 1.10±0.10 0.50±0.35模型組 6 210.3±8.41 5.31±1.57 26.12±7.89 19.12±4.32 124.1±2.87 2.79±0.21 2.63±0.20大黃酸治療組 6 256.3±5.12 2.53±0.20 24.03±1.24 11.21±4.27 87.9±1.87 1.74±0.19 7.81±0.21

圖2 模型組腎小球病理改變電鏡下圖片（免疫組化，×1 000）

2.4 足突細胞上nephrin的表達 nephrin特異性的表達于腎小球足突細胞上，通過電鏡觀察，模型組足突細胞上nephrin陽性明顯，大黃酸治療組陽性明顯減少，半定量分析見：大黃酸治療組與模型組比較，腎小球nephrin陽性面積百分比差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組足突細胞nephrin表達

3 討 論

研究發現，DN在早起正確治療，可能逆轉腎小球、腎小管病理改變，但是，一旦進入Ⅳ期，病理改變就難以逆轉，因此，在DN的治療中應該早起診斷及治療，既往研究發現，GBM成分改變及細胞外基質聚集是最終導致DN的關鍵病理改變，然而這些研究并不能完全解釋蛋白尿及腎小球濾過率的改變，而近期研究發現足突細胞的損傷在DN的發病中起了重要作用，而nephrin基因表達的nephrin蛋白在足突細胞的裂孔隔膜中起重要作用，是裂空隔膜的主要成分［7－9］。本實驗研究大黃酸在早期使用，對足突細胞裂空隔膜的主要成分nephrin基因表達的影響。

目前，國內外大部分研究，都是針對腎臟血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）升高的研究，研究認為高血糖等作用最終導致AngⅡ升高，使機體血流動力學的改變，從而讓腎臟處于高壓力、高濾過、高灌注的病理情況下，最終導致腎臟損傷［10］。今年研究發現，使用血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）、血管緊張素受體（accounting Research Bulletins，ARB）等藥物阻斷AngⅡ或者AT1發揮生物學效應。而針對足突細胞及nephrin基因的研究較少，足突細胞即腎足突細胞，小囊臟層上皮細胞，它附著于GBM的外側，是一種高度分化和特異性的細胞，呈星狀多突狀，主要由3部分組成：細胞體、主突、足突，足突呈指狀交叉覆蓋于GBM外側，并通過黏附分子及糖蛋白分子將二者相連，足突細胞之間由極薄的裂空隔膜相連接，構成一種拉鏈式結構，從而與GBM及腎小球內皮細胞共同構成腎小球濾過屏障，是具有電荷及相對分子質量選擇性的分子篩［11－12］。正常情況下，這種電荷屏障及機械屏障能保持腎臟正常的濾過功能，然而在糖尿病病程進展過程中，由于高血壓等諸多因素，可通過細胞內因子、活性氧基團及改變血流動力學等導致足突細胞的壞死及凋亡，足突細胞數目減少及功能減弱以及GBM的裸露等原因最終導致患者出現蛋白尿。近期研究發現，足突細胞的裂空隔膜上的蛋白分子的表達與nephrin基因密切相關，而該基因與腎小球濾過屏障選擇功能密切相關［13－14］，并且nephrin下調及重新分布先于腎小球組織損害，是DN病程中的早期改變，且nephrin表達與蛋白尿的程度呈負相關，而已經有研究發現纈沙坦在阻止了nephrin下調后，小鼠蛋白尿有明顯下降［15］，然而針對DM引起足突細胞的損傷，除了嚴格控制血糖、抑制腎素－血管緊張素－醛固酮系統（renin－angiotensin－aldosterone system，RAAS）外，并無其他治療方法，因此積極尋找抑制足突細胞損傷，控制DN病情進展的藥物迫在眉睫。

近年來研究發現，大黃酸具有改善糖代謝，逆轉胰島素抵抗作用，對治療DN有一定效果，但是大黃酸除了抑制內皮細胞PAI－1的表達，保護內皮功能逆轉胰島素抵抗預防糖尿病高血糖對腎臟的影響外，是不是還對腎臟足突細胞本身有一定作用，目前尚無研究。本實驗采用STZ 60mg／kg一次性腹腔注射方式制作大鼠DN模型，并給予大黃酸灌胃給藥8周，后取腎臟行病理活檢及免疫組化發現模型組與大黃酸治療組比較，nephrin表達下調受到抑制，與對照組比較差異有統計學意義，本實驗研究發現大黃酸對DN不止與改善糖代謝、逆轉胰島素抵抗、抗炎等功能有關，而且與nephrin基因的表達有一定關系，可能是通過nephrin蛋白的損傷，維持足突細胞完整性有一定作用，但是最佳劑量及不良反應等尚需進一步實驗來證實。

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