吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽對喉癌Hep－2細胞增殖和凋亡的影響

曹雪秋

（湖北民族學院附屬民大醫院耳鼻喉頭頸外科，湖北 恩施 445000）

喉癌是頭頸部腫瘤中的高發病，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，占耳鼻咽喉惡性腫瘤的7.9%～35%，也是呼吸道僅次于肺癌的第二位高發癌［1］。其發病可能與吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染及激素水平等多種因素有關。核因子κB（nuclear factor kappaB，NF－κB）作為一種核轉錄因子廣泛存在于多種真核細胞內，參與細胞的炎癥反應和免疫應答，調控細胞增殖與凋亡，在腫瘤細胞的發生、發展中起著重要的作用［2－3］。吡咯 烷 二 硫 代 氨 基 甲 酸 鹽 （ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）是一種可以通透細胞膜的 NF－κB活化抑制劑，可以在多種細胞中抑制NF－κB的激活［4］。本研究擬通過體外細胞實驗來探討PDTC對喉癌Hep－2細胞的凋亡和增殖的影響，為進一步發掘有效治療喉癌的藥物和闡明相關機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 喉癌Hep－2細胞購自中科院上海細胞所。1640培養基和胎牛血清（美國 Hyclone公司），PDTC（中國碧云天生物科技研究所），MTT試劑（中國碧云天生物科技研究所），Trizol（美國Invitrogen公司），RNA反轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），核酸染料（美國 Bio－Rad公司），p－IκB單克隆抗體、Bcl－xL單克隆抗體、XIAP單克隆抗體（美國Sigma公司），流式細胞儀（美國BD公司），CFX 96TM PCR儀（美國Bio－Rad公司），凝膠成像儀（美國Bio－Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hep－2細胞接種于50mL細胞培養瓶，用含有10%胎牛血清的1640培養基培養細胞。培養瓶置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中。細胞貼壁生長后2d換液1次，細胞融合至80%左右時消化傳代。

1.2.2 Hep－2細胞的分組及培養 取對數生長期細胞配制成濃度為5×104／mL的Hep－2細胞懸液，每孔加入200μL細胞懸液，將細胞接種于96孔板。細胞分為3個組：對照組、實驗分為50、100μmol／L組。每組設3個復孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱內培養。細胞貼壁后實驗組加入PDTC處理細胞，對照組加入磷酸鹽緩沖液。各組分別培養24h后，每孔加入濃度為5mg／mL的 MTT 20μL繼續培養4h，小心吸棄孔內液體，加入150μL二甲亞砜，酶標儀A490 nm測定各孔OD值。

1.2.3 Hep－2細胞凋亡的流式細胞術檢測 50、100μmol／L組處理細胞24h后，0.125%的胰蛋白酶消化后離心，將細胞轉入流式管，用結合緩沖液重懸細胞至5×105／mL，取195 μL，加入FITC標記的Annexin－V 5μL，室溫避光反應約10 min，離心后用190μL結合緩沖液重懸細胞，再加入濃度為50 μg／mL的PI 10μL，避光反應5min后，加入200μL緩沖液，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測。對照組不加任何試劑。

1.2.4 RT－PCR 檢測 Bcl－xL 及 XIAP的 表達 對 照 組、50 μmol／L組，100μmol／L組的 Hep－2細胞接種于6孔板。處理細胞12h后，用Trizol法提取細胞總mRNA，逆轉錄試劑盒轉為cDNA。引物采用Primer 5軟件設計，引物由上海生工生物工程有限公司合成，Bcl－xL 引物上游序列：5′－GTG GCC GGC GTG GTT－3′，下游序列：5′－GAG GGT AGA GTG GAT GGT CAG TGT－3′；XIAP 引物上游序列：5′－TTT TTC CCC TGT CCC TTT GA－3′，下游序列：5′－ACA CAG GGC CAA ATC ACA TTA TAT AC－3′。RT－PCR反應條件為預變性95℃3 min；變性95℃10s；退火60℃30s；返回95℃10s，擴增39個循環；65～95℃，每0.5℃5s梯度遞增；終止反應。采用熒光定量PCR分析軟件Bio－Rad CFX manager分析結果。

1.2.5 p－IκB、Bcl－xL及 XIAP的蛋白表達的 Western－blot檢測 3組細胞處理12h后，分別加入適量的RIPA細胞裂解液于冰上裂解細胞，提取總蛋白。按照碧云天公司BCA試劑盒進行蛋白定量。取50μg蛋白進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離，濃縮膠電壓60V，分離膠電壓80V。電泳結束后轉膜至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗p－IκB、Bcl－xL及XIAP（抗體稀釋度為1∶500），內參為 GAPDH（抗體稀釋度為1∶500），置4℃冰箱內過夜，復溫后用TBST洗膜，加入二抗為辣根過氧化物（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG（抗體稀釋度為1∶1 000）孵育1.5h。電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒檢測信號，凝膠成像儀采集圖像，結果采用Quantity One軟件進行條帶灰度分析，實驗重復3次。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PDTC對 Hep－2細胞的生長抑制作用 PDTC對50 μmol／L組和100μmol／L組的 Hep－2細胞生長抑制與對照組比較，差異有統計學意義，PDTC的濃度越大，抑制效果越明顯（P＜0.05），見表1。

表1 3組Hep－2細胞增殖的MTT法檢測結果比較

2.2 PDTC對Hep－2細胞凋亡的影響 流式細胞術結果見圖1。Hep－2細胞經 PDTC處理24h后，50μmol／L組和100 μmol／L組細胞凋亡率分別 為 （25.1±2.18）% 和 （35.4±2.62）%，與對照組（3.12±1.07）%比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 3組Hep－2細胞凋亡的流式細胞術檢測

表2 3組Hep－2細胞Bcl－xL及XIAP的mRNA表達水平比較

表2 3組Hep－2細胞Bcl－xL及XIAP的mRNA表達水平比較

＊：P＜0.05，與對照組比較；△：P＜0.05，與50μmol／L組比較。

組別 Bcl－xL相對表達量 XIAP 1.00±0.00 1.00±0.00 50μmol／L組 0.83±0.09＊ 0.78±0.07＊100μmol／L組 0.66±0.05＊△ 0.59±0.11相對表達量對照組＊△

2.3 PDTC對 Hep－2細胞的Bcl－xL及XIAP的 mRNA表達的影響 50μmol／L組和100μmol／L組Bcl－xL mRNA與XIAP mRNA表達比對照組低（P＜0.05）。100μmol／L PDTC比50μmol／L PDTC作用更為明顯（P＜0.05），見表2。

2.4 PDTC對 Hep－2細胞的p－IκB、Bcl－xL及 XIAP的蛋白表達的影響 Western－blot結果見圖2。50μmiol／L組和100 μmol／L組p－IκB、Bcl－xL與 XIAP蛋白表達比對照組低（P＜0.05）。

圖2 3組 Hep－2細胞p－IκB、Bcl－xL與 XIAP蛋白的表達

3 討 論

IKK／NF－κB信號通路被證實在多種腫瘤中異常激活，促進腫瘤細胞增殖、抗凋亡、轉移侵襲、血管生成和炎癥反應等［5］。經典的IKK／NF－κB信號通路途徑［6］主要影響的是 NF－κB家族中的RELA和p50成員，無刺激信號時胞質中RelA：p50與抑制因子IκB結合而處于靜止狀態，當刺激信號出現時胞質中IκB激酶（IκB kinase complex，IKK）激活使與RelA：p50結合的IκB磷酸化激活而從三聚體脫落降解，RelA：p50二聚體則進入核內啟動或增強相關靶基因轉錄。Hideshima等［7］通過IκB抑制劑阻斷NF－κB信號通路，發現能夠降低IGF－1H和IL－6的分泌，抑制多發性骨髓瘤細胞在體內外的生長和增殖。通過抑制腫瘤細胞增殖促進凋亡發生已經成為目前腫瘤的研究和治療中重要的策略［8］。

PTDC是一種抗氧化劑，為NF－κB的特異性抑制劑，其功能一方面能夠阻止NF－κB亞基p65的激活，另一方面可通過抑制IκB的降解而減少NF－κB的核轉位，從而阻斷IKK／NF－κB信號通路的激活［9］。Liu等［10］研究發現，PDTC能抑制卵巢癌細胞的增殖，減少促炎性細胞因子的分泌，促進凋亡的發生。但其對喉癌細胞的影響的研究還鮮有報道。本實驗通過MTT實驗顯示隨PDTC藥物濃度的增加，喉癌細胞的增殖水平明顯下降。RT－PCR及 Western－blot結果顯示PDTC處理Hep－2細胞后，p－IκB表達水平降低，表明 PDTC 能夠阻斷IκB的活化。

Bcl－xL可阻斷Bax對線粒體外膜的破壞而發揮抗凋亡的作用，還可干擾抑制Caspase－3和Caspase－8的活性、維持線粒體膜電位水平和控制活性氧的毒性而在細胞內發揮抗凋亡作用［11］。有研 究 顯 示，Bcl－xL 在 喉 癌 中 存 在 高 表 達［12］，Wang等［13］通過多基因聯合RNAi技術沉默Bcl－xL基因后，Hoechst染色和電子顯微鏡觀察喉癌Hep－2細胞的凋亡增加，增殖水平明顯下降。NF－κB介導的抗凋亡作用實質上是依賴于增強凋亡抑制基因的轉錄實現的，最具代表性的基因如XIAP、cIAP1、Bcl－xL等能有效阻止細胞凋亡。XIAP不僅能抑制Caspase－3和Caspase－7還能抑制促凋亡蛋白JUN的激活［14］。XIAP在喉鱗狀細胞癌中相對于正常組織明顯升高，與喉癌的臨床分期和病理學分期明顯相關［15］。沉默p65基因能夠明顯抑制XIAP及cIAP1等蛋白的表達［14］。本實驗發現，PDTC處理Hep－2細胞后，細胞凋亡率增加，XIAP mRNA和蛋白表達水平下降，表明通過抑制IκB的激活能夠降低XIAP的表達。

綜上所述，通過PDTC處理人喉癌Hep－2細胞后，細胞增殖水平明顯受到抑制，流式細胞術顯示細胞凋亡增加，RTPCR及 Western－blot結果顯示細胞IκB磷酸化激活減少，BclxL、XIAP mRNA及蛋白表達水平降低。顯示PDTC能夠通過阻斷IκB的活化，降低與抗凋亡相關基因Bcl－xL及XIAP的表達從而抑制增殖促進凋亡，喉癌細胞凋亡增加可能與NF－κB信號轉導通路的阻斷有關。針對NF－κB信號通路的治療策略可能會給喉癌的治療提供新的思路和治療靶點。

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