BMP2基因重組慢病毒載體質粒的構建及鑒定＊

林昭偉，李 奇，林荔軍，劉云龍，帥 明，謝小波

（南方醫科大學珠江醫院骨科中心，廣州 510282）

骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是促進骨化的主要因子，可在骨損傷局部及異位促進細胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，也是惟一能夠單獨在異位誘導骨化形成的信號分子，這使其在骨關節疾病特別是骨折、骨缺損的臨床治療中具有極大的潛在應用價值［1－5］。將BMP2復合載體材料在特定部位釋放，存在體內半衰期短，容易被體液沖走或稀釋等缺點，很難保持局部有效治療濃度。慢病毒載體對非分裂細胞能進行高效的轉導，攜帶目的基因整合到靶細胞基因組，使之能長期、穩定和安全地在全身或局部表達，成為目前較理想的基因轉移載體［6－8］。為此，本研究嘗試構建重組慢病毒載體質粒pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP，為骨缺損的基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒載體質粒pLV.Des2d.P／neo，pDONR221，模板DNA，大腸桿菌Stbl3購自Cyagen公司，Gateway?BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix，Gateway?LR ClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix購自Invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購自Qiagen公司，質粒小提試劑盒購自Tiangen公司，Taq DNA Polymerase，dNTP Mix，GeneRuler？1kb DNA Ladder購自Fermentas公司，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase購自Takara公司，XmaⅠ和EcoRⅤ限制性內切酶購自Neb公司。其他試劑均為進口或國產。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 attB1－Kozak－BMP2－T2A－EGFP－attB2。

1.2.1.1 引物設計與合成 根據Genbank的BMP2基因編碼區（CDS）和 Gateway技術設計相應引物。attB1－Kozak－BMP2－F基因引物：5′－GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTG CCA CCA TGG TGG CCG GGA CCC GC－3′。BMP2－T2A－R－1基因引物：5′－AAG ACT TCC CCT GCC CTC TCC GGA GCC GCG CAC CCA CAA CCC TCC－3′。T2A－R－2基因引物：5′－GGC CGG GAT TTT CCT CCA CGT CCC CGC ATG TTA GAA GAC TTC CCC TGC CCT CT－3′。T2A－EGFP－F基 因 引 物：5′－CGT GGA GGA AAA TCC CGG CCC CAT GGT GAG CAA GGG CGA GG－3′。attB2－EGFP－R基因引物：5′－GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG－3′。引物由廣州賽業生物公司合成。PCR融合過程示意圖（圖1）。

1.2.1.2 PCR反應體系及擴增程序 取一高壓滅菌0.2mL EP管，并建立以下反應體系：5×Primer STARTMBuffer（Mg2＋Plus）：10μL；dNTP Mixture（2.5μmol）：4μL；引物－F（10μmol）：1μL；引物－R（10μmol）：1μL；模板 DNA：1μL；Primer STARTMHS DNA Polymerase：0.5μL；補加雙氧水至總體積50μL。98℃預變性3min，98℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸1.5 min共30個循環，72℃延伸5min，6×loading Buffer終止反應，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收參照QIA－quick的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進行回收，－20℃冰箱保存。

1.2.2 利用 Gateway Technology構建 pDown－BMP2－T2AEGFP 在25℃的條件下BP反應1h，反應體系：attB1－KBMP2－T2A－EGFP－attB 2∶100ng；pDONR 221∶100ng；BP clonase：1μL；TE buffer：up to 5μL。加入0.5μL蛋白酶 K于37℃終止反應10min，轉化BP反應產物到大腸桿菌Stbl3，把100μL轉化物涂到含有50μg／mL Kan的LB平板上37℃孵育過夜。XmaⅠ和EcoRⅤ雙酶切鑒定篩選陽性克隆，挑取陽性克隆質粒，并將陽性克隆的質粒送賽業生物公司測序，測序引物：pUpDo－flank－F：CGG CCA GTC TTA AGC TCG GG；pUpDo－flank－R：AAT ACG ACTC ACT ATA GGG GA；W1F：ACA CCA GGT TGG TGA ATC AG。

1.2.3 利用 Gateway Technology構建 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP 在25℃條件下LR反應16h，反應 體 系：pDown－BMP2－T2A－EGFP：15.02ng；pUp－EF1A：12.89ng；母載體pLV.Des2d.P／neo：60.28ng；LR clonase：1 μL；TE buffer：up to 5μL。加入0.5μL蛋白酶K于37℃終止反應10min。轉化LR反應產物到大腸桿菌Stbl3，菌落PCR篩選陽性克隆，反應體系：10×Taq Buffer with（NH4）2SO4：3μL；dNTP Mixture（2μmol）：3μL；MgCl2：2μL；引物－F（10μmol）：1.2μL；引物－R（10μmol）：1.2μL；Taq DNA polymerase：1.5μL；模板DNA：2μL；滅菌水：16.1μL；總體積30 μL。94℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min共29個循環，72℃延伸5min。挑取陽性克隆質粒，陽性克隆送交賽業生物公司測序，測序引物：pLV－Final－internal－F：CAA GTT TGT ACA AAA AAG CAG GCT；pLVFinal－internal－R：AGC CTG CTT TTT TGT ACA AAC TTG。

圖1 PCR融合過程示意圖

2 結 果

2.1 pDown－BMP2－T2A－EGFP的構建（圖2） 隨機挑取2個克隆，pDown－BMP2－T2A－EGFP用限制性內切酶 XmaⅠ和EcoRⅤ雙酶切后，酶切條帶理論大小為1 100bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆，測序結果同GenBank中報道序列一致，波譜未列出。

圖2 pDown－BMP2－T2A－EGFP酶切鑒定

2.2 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2－T2A－EGFP重組質粒構建（圖3） 隨機挑取6個克隆，菌落PCR鑒定條帶理論大小為2 000bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆，測序結果同GenBank中報道序列一致，波譜未列出。載體結構圖譜見圖4。

圖3 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2－T2A－EGFP PCR鑒定

圖4 pLV.EX2d－EF1A＞BMP－2／T2A／EGFP載體結構圖譜

3 討 論

生物活性因子在促進骨缺損修復過程中發揮極其重要的作用，而促進新骨形成的活性因子顯得尤為重要。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是參與骨形成的重要活性物質，其中BMP2是BMP家族成員中作用最強的因子。BMP2直接或通過載體局部應用可促進骨形成［1－2］。但BMP2屬于小分子物質，如果單純將其于局部注射，勢必被組織液稀釋或血液帶走，同時BMP2半衰期較短，在注入體內后，輕易地被體內蛋白水解酶水解失去活性，難以發揮有效的骨誘導作用。而近年來發展的緩釋技術則存在操作復雜、包封率低、價格昂貴，且有效安全的局部劑量很難達到，生物活性不能得到最大利用，難以全面滿足組織工程骨體內修復這一復雜過程的需要。因此，尋找一種有效的BMP2局部穩定、緩慢釋放方法就顯得極為重要。

基因治療可使生物活性因子在局部穩定地釋放，在骨缺損修復領域中顯示出良好的運用前景。許多研究證實，基因治療可有效促進骨再生［9－12］。目前，基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。由于病毒基因組結構簡單，易于改造和操作，且感染效率高，有較高靶細胞特異性，這些都是其他載體系統無法比擬的。慢病毒載體是一類逆轉錄病毒載體，它既能夠感染分裂細胞，也能夠感染非分裂細胞，由于慢病毒載體能夠感染大多數非分裂細胞，以及具有高效地整合和穩定地表達目的基因于靶細胞的能力，所以，已被廣泛應用于各種基因治療實驗研究［13－15］。Gateway技術是基于λ噬菌體位點專一重組系統的一種通用的克隆技術，能夠快速地、高特異性地將異源DNA片斷克隆到不同的載體中。這一技術在插入的目的DNA片段兩端整合att L1和att L2兩個側端重組序列，來構建一個類似通道的結構并稱之為入門克隆。本研究顯示，直接調取BMP2基因，能與數據庫序列保持高度一致，減少變異，利用 BP 反 應 構 建 入 門 克 隆 pDown－BMP2－T2A－EGFP，以pLV.Des2d.P／neo為目的載體利用LR反應構建pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP。

經過測序證明，本研究成功構建了攜帶BMP2基因的慢病毒載體質粒，同時加入了與之共表達的報告基因EGFP和NEO抗性基因，有利于感染后細胞的觀察和篩選，為下一步進行病毒包裝及轉染奠定基礎。

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