糖尿病對大鼠肝纖維化組織TIMP－1／MMP－1表達的影響＊

陳 楓，楊愛萍，李 燕，史小玲，唐小平，唐 莉，王曉燕，陳 莊△

（1.瀘州醫學院附屬醫院，四川 瀘州 646000；2.蘭州大學第二醫院，蘭州 730030）

糖尿病是以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群。中國糖尿病和糖尿病前期患病率分別高達9.7%和15.5%［1］。持續性高血糖對許多臟器如腎臟、心腦血管纖維化具有明顯促進作用，與肝臟纖維化的關系也在研究之中［2－3］。但其機制未能完全闡明。肝細胞外基質（extracellular matrix，ECM）分解代謝平衡主要是由TIMPs／MMPs系統調控，其中金屬蛋白酶組 織 抑 制 劑－1 （tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）／金 屬 基 質 蛋 白 酶－1 （matrix metalloproteinase－1，MMP－1）的變化更能準確反映肝臟中ECM的合成和降解情況［4］。為了更好地分析高血糖對肝纖維化的影響，TIMP－1／MMP－1系統在糖尿病相關性肝纖維化中的作用，現將糖尿病對大鼠肝纖維化組織TIMP－1／MMP－1表達的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司）；檸檬酸、檸檬酸三鈉（上海前塵生物公司）；四氯化碳（國藥集團化學試劑公司）；透明質酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原蛋白（collagen typeⅣ，C－Ⅳ）和Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PⅢNP）試劑（鄭州安圖生物公司）；總RNA試劑盒（北京天根生化公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連寶生物公司）；MMP－1、TIMP－1、β－actin RT－PCR擴增引物（上海生工合成，引物序列見表1）；微量血糖測定儀，血糖試紙（美國強生公司）。pH4.5的檸檬酸緩沖液配制：A液0.1mol／L的檸檬酸；B液0.1mol／L的檸檬酸三鈉，A∶B＝1∶1.32（用前配制）；1%STZ溶液配制：稱所需質量的STZ，溶于其相應體積的pH4.5的檸檬酸緩沖液中（腹腔注射前溶解）。

表1 RT－PCR基因及引物序列

1.2 動物模型 清潔級健康雄性SD大鼠，體質量300～350 g，共40只，購于重慶第三軍醫大學動物實驗中心。大鼠適應性飼養1周，隨機分為正常對照組、糖尿病組、肝纖維化組、糖尿病肝纖維化組（雙模型組），各10只。實驗前大鼠尾尖采血，測定血糖值，正常大鼠方可用于試驗。正常對照組：腹腔注射同體積的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液和花生油溶液。糖尿病組：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾尖采血，測定血糖大于16.7mmol／L為糖尿病模型大鼠［5］。肝纖維化組：皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次劑量0.4mL／kg，以后每隔3天注射0.2mL／kg。雙模型組：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾靜脈采血，測定血糖，7d后重復測定血糖，血糖大于16.7mmol／L的大鼠皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次劑量0.4mL／kg，以后每隔3天皮下注射0.2mL／kg，8周末腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，處死各組大鼠。心臟取血、剖腹取肝組織。

1.3 指標檢測 全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶（alaniine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotran－sferase，AST）、血漿清蛋白（albumin，ALB）和清蛋白／球蛋白（A／G）。化學發光法測定 HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ。RT－PCR（SYBR Green相對定量法）檢測肝臟組織α－平滑肌肌動蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、MMP－1和TIMP－1表達。取肝臟組織50mg磨碎，提取總RNA，制備cDNA模板，反轉錄反應體系：MgCl22μL、10RT Buffer 1μL、dNTP Mixture 1μL、RNase Inhibittor 0.25μL、AMV Reverse Transriptase 0.5μL、Oligo dT－Adaptor Primer 0.5μL、RNase Free d H2O 3.75μL、樣品RNA 1μL、Total volume 5μL。30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。

RT－PCR反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dH2O 8.5μL、樣品RNA 2μL、Total volume 25μL。95℃30s，95℃5s，59.5℃10s，檢測實時熒光，共40個循環；65～95℃生成融解曲線，每個步驟10s，＋0.5℃／循環并行實時熒光檢測，共60個循環。

病理檢測：實驗結束以后，將大鼠處死，剖腹取肝臟，固定，脫水，石蠟包埋，VG染色。

1.4 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件進行數據處理，計量資料以表示。對樣本數先行方差齊性檢驗，方差齊時用One－Way ANOVA檢驗。方差不齊時用Kruskal－Wallis H檢驗比較總的差異，再用Mann－Whitney U檢驗進行兩組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠肝功能指標 與正常對照組比較，肝纖維化組和雙模型組ALT、AST濃度明顯升高，ALB、A／G明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組ALT、AST濃度明顯升高和ALB、A／G明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組ALT、AST升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 大鼠血清肝纖維化指標 與正常對照組比較，肝纖維化組、雙模型組HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ 明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組HA、LN、PⅢNP、C－Ⅳ 明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組HA、C－Ⅳ升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 肝組織VG染色變化 正常對照組肝臟肝小葉結構正常，肝細胞索排列規則有序，未見脂肪變性、壞死，無膠原纖維增生；糖尿病組肝臟結構基本正常，少量出現炎性壞死、脂肪變性；肝纖維化組肝細胞廣泛脂肪變性、壞死，炎性細胞浸潤，以匯管區及中央靜脈周圍較重。有纖維組織增生的情況，但未形成假小葉；雙模型組中大部分肝小葉結構破壞，肝細胞索排列失去放射狀結構，纖維結締組織增生形成寬窄不一的纖維條索，伸入肝實質中，形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，形成假小葉。見圖1和表4。

表2 4組大鼠肝功能指標比較

表2 4組大鼠肝功能指標比較

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n ALT（U／L） AST（U／L） ALB（g／L） A／G正常對照組 10 68.460±17.534 106.928±19.659 42.582±7.667 1.235±0.420糖尿病組 10 85.723±18.998 112.615±20.178 42.446±7.915 1.228±0.143肝纖維化組 10 171.532±17.415ab 175.518±23.711ab 32.046±9.982ab 0.711±0.312ab雙模型組 10 224.914±23.321abc 234.058±18.001abc 31.762±7.768ab 0.703±0.408ab

表3 4組大鼠肝纖維化指標濃度的比較（ng／mL

表3 4組大鼠肝纖維化指標濃度的比較（ng／mL

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n HA C－Ⅳ PⅢNP LN正常對照組 10 88.856±11.848 8.206±0.953 8.717±4.546 6.026±2.331糖尿病組 10 97.808±19.123 10.991±3.315 8.720±2.582 7.085±2.404肝纖維化組 10 194.892±14.594ab 16.223±3.217ab 15.122±5.335ab 10.561±1.319ab雙模型組 10 251.484±63.466abc 20.184±5.032abc 15.646±2.992ab 10.811±4.026ab

圖1 4組大鼠肝組織膠原纖維影像表現（VG染色，×100）

表4 4組大鼠纖維化分期和計分的比較）

表4 4組大鼠纖維化分期和計分的比較）

a：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n 分期（n）0 1 2 3 4 計分（分）正常對照組 10 10 0 0 0 0 0糖尿病組 10 10 0 0 0 0 0肝纖維化組 10 0 0 4 4 2 8.7±5.420雙模型組 10 0 0 2 4 4 13.6±6.813a

2.4 肝臟組織α－SMA、MMP－1和TIMP－1基因表達 與正常對照組比較，肝纖維化組和雙模型組α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表 達 升 高，差 異有 統 計 學 意 義 （P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組和雙模型組α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組α－SMA和TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。正 常 對 照 組 和 糖 尿 病 組 中 α－SMA、TIMP－1 及TIMP－1／MMP－1基因表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），各組間MMP－1基因表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 4組大鼠肝臟組織中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表達水平的比較

表5 4組大鼠肝臟組織中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表達水平的比較

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n α－SMA TIMP－1 MMP－1 TIMP－1／MMP－1正常對照組 10 1.412±0.237 1.103±0.777 1.064±0.681 0.973±0.772糖尿病組 10 1.992±0.166 1.134±0.306 1.134±0.122 1.000±0.091肝纖維化組 10 3.285±0.054ab 3.816±0.887ab 1.488±0.421 2.561±0.307ab雙模型組 10 17.927±0.672abc 6.920±0.588abc 1.619±0.524 4.279±1.414abc

3 討 論

糖尿病與肝纖維化有密切關系，可促進肝纖維化的進展，增加肝硬化和肝癌的發生［6－8］。同時，慢性肝損傷也可以影響糖代謝，形成惡性循環，但其機制未能闡明。高血糖作為糖尿病的重要表現，是各型糖尿病的共同特征。本研究采用鏈尿佐菌素誘導建立糖尿病模型，通過破壞胰島β細胞，誘發大鼠形成糖尿病。四氯化碳是常用的中毒性肝纖維化誘導物，通過細胞色素氧化酶代謝為三氯甲基自由基從而導致肝細胞損傷，肝細胞出現壞死、凋亡［9］，反復刺激形成了炎癥細胞集聚、釋放細胞因子觸發間質組織的過量膠原纖維產生肝纖維化。當肝纖維發生時，細胞中ALT、AST釋放于血清是肝細胞炎癥和壞死的血清學指標；ALB、A／G是肝細胞合成代謝功能的指標，其降低程度與肝臟合成功能損害程度呈正比。ECM主要由膠原蛋白、LN、HA等成分組成，所以，ECM及其代謝產物是研究血清標志物的首選。目前，HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ為常見的臨床檢測肝纖維化血清學指標，同時酶促化學發光法檢測具有密度好、準確性高、溶血對檢測干擾少等優點［10－11］。本研究結果顯示，糖尿病組與正常對照組比較，各項指標沒有顯著區別，表明早期糖尿病對肝臟功能影響較小。肝纖維化組中，ALT、AST、HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ濃度高于正常對照組和糖尿病組，ALB、A／G明顯降低（P＜0.05），加之病理改變，證實造模成功。雙模型組與肝纖維化組比較，ALT、AST、HA和C－Ⅳ差異有統計學意義（P＜0.05），雙模型組是肝纖維化模型加糖尿病模型，說明糖尿病加重了肝臟纖維化程度，促進了肝纖維化的發展。其結果也與組織切片VG染色結果相符合，在大鼠纖維化分期和計分的比較中，雙模型組與肝纖維化組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

肝纖維化是各種慢性肝病的病理特征，其發生機制是ECM過度增生和異常沉積。研究表明，肝纖維化發生中心環節是肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活和增殖。當各種因素引起HSC激活后，HSC轉變為肌成纖維細胞并特異性表達α－SMA，主要表達于HSC胞核，說明α－SMA是HSC激活標志，進而成為提示肝纖維化病情嚴重程度的重要指標［12］。通過RT－PCR結果觀察到，與正常對照組和糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組α－SMA的表達明顯升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組α－SMA的表達升高（P＜0.05）。這與方瑜潔等［13］的研究結果一致，提示高血糖可以促進肝臟HSC活化、增殖，從而加重大鼠肝纖維化的程度。因此，HSC激活在糖尿病相關性肝纖維化的形成過程中可能起著重要的促進作用。Sugimoto等［14］通過體外實驗發現，高血糖可以引起HSC增生和Ⅰ型膠原的產生，提示高血糖是促進肝纖維化發展的重要因素。其他體外實驗也觀察到，不同高濃度的葡萄糖均能刺激HSC并導致HSC增殖，且DNA合成呈劑量依賴性［15］。所以，糖尿病持續性高血糖對肝纖維化的影響可能是通過激活HSC和增加膠原ECM的產生，進而加重肝纖維化。

肝纖維化的產生是由于MMPs活性下降和（或）TIMPs活性升高導致ECM的合成和降解的失衡，從而出現ECM在肝內過度沉積。MMPs是一組鋅離子依賴酶，它對于ECM中細胞外大分子如膠原具有降解作用，因此，是調節ECM動態平衡最重要的一大酶系［16］；TIMPs是一組有抑制MMPs功能的活性多肽，與等比例的MMPs以共價鍵可逆結和形成復合體，從而抑制MMPs的活性。所以，TIMPs／MMPs系統在維持肝臟中ECM平衡起著重要作用。MMP－1是MMPs家族的一員，主要降解ECM中的Ⅰ、Ⅲ型膠原［17］，MMP－1的活性主要受特異性抑制物TIMP－1的調節。有研究表明，在肝纖維化發展過程中，TIMP－1的表達增強，TIMP－1／MMP－1的比值升高，使ECM降解減少，增加了膠原纖維的積累并促進肝纖維化的發展，是肝纖維化形成的重要因素［18］。因此，TIMP－1／MMP－1比值的改變更能準確地反映肝臟中ECM合成和降解的情況［4］。本研究結果表明，與正常對照組和糖尿病組相比，肝纖維化組中TIMP－1表達增加、MMP－1變化不明顯，從而引起的TIMP－1／MMP－1改變導致肝纖維化的發生，與文獻［19］一致。與肝纖維化組比較，雙模型組 TIMP－1、TIMP－1／MMP－1表達升高（P＜0.05），由此說明高血糖狀態下大鼠肝纖維化程度加重與TIMP－1表達增加相關，而不是 MMP－1表達減少，所以，TIMP－1／MMP－1失衡加劇了ECM的形成。糖尿病持續性高血糖影響TIMP－1／MMP－1系統的平衡，其可能的機制：高血糖激活了HSC的表達，激活的HSC釋放大量的TIMP－1，從而導致了TIMP－1／MMP－1失衡。其可能的機制還有高血糖狀態可能分泌大量 TNF－α、IL－1等炎癥介質［20］，它們可以進一步刺激 HSC 增 殖，影 響 TIMP－1／MMP－1的 平 衡。Wakisaka等［21］研究認為，在高血糖情況下，ECM成分的改變會影響MMPs的表達。正常情況下，ECM中的正常成分通常作為ECM分泌的負反饋調節信號。在血糖高的情況下，這種負反饋調節機制被破壞，影響了TIMP－1／MMP－1正常表達和形成ECM的沉積。

因此，糖尿病加重肝纖維化發生的機制與TIMP－1／MMP－1的失衡有密切關系。深入研究糖尿病肝纖維化過程中HSC激活和TIMP－1／MMP－1調節性失衡異常的機制，可以更好地闡明糖尿病相關性肝纖維化的發病機制，為臨床上防治糖尿病相關性肝纖維提供新的思路和治療方法。

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