索拉非尼誘導HepG2細胞凋亡過程中Mcl－1與bFGF－2的表達及意義＊

廖 于，李照東，左的于，劉 宇，晏 勇，左國慶

（1.重慶醫藥高等專科學校 401331；2重慶醫科大學第二臨床學院 400010；3重慶醫科大學第一臨床學院 400016；4.重慶市中醫院 400021）

索拉非尼是世界上第一個新型多靶向性的抗腫瘤的口服藥物，絕大部分患者對其應答效果好，癥狀緩解率高，不良反應小［1］。本實驗進一步驗證索拉非尼在體外引起肝癌細胞凋亡，并測定Mcl－1及bFGF－2的表達，探討髓樣細胞白血病－1蛋白質（Mcl－1）、人堿性成纖維細胞生長因子－2（bFGF－2）在肝癌細胞凋亡過程中表達變化的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 索拉菲尼購于德國拜耳制藥（每粒200mg），CCK－8試劑盒購于江蘇碧云天生物技術研究所，AnnexinV－EGFP凋亡試劑盒購于上海貝博生物公司，人bFGF－2ELISA試劑盒購于武漢博士德生物公司，鼠抗人 Mcl－1多克隆抗體購于美國Santa Cruz，人肝癌細胞株HepG2保存于重慶醫科大學肝病研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株HepG2細胞培養于10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養基中（含有1%的雙抗），置于37℃，5%CO2培養箱中培養。細胞為貼壁生長，每1～2天換液，2～3d傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 索拉菲尼溶液的制備 用少量100%的二甲亞砜（DMSO）完全溶解索拉菲尼，用1640培養基稀釋到所需濃度備用，使DMSO的最終濃度低于0.5%。

1.2.3 CCK－8試劑盒檢測藥物對腫瘤細胞增殖的影響 將對數生長期細胞常規消化后按5×103／孔接種于96孔板，培養12h后加入藥物。實驗分組及相關濃度參照文獻［2］定為索拉菲尼1.5、3.0、6.0μmol／L組，每組設3個復孔，另設對照組。每孔所加不同濃度藥物對應的量均為20μL，加入培養基使每孔的最終體積為200μL。分別作用24、36、48、60、72h后每孔加入20μL CCK－8，37℃下作用1h，酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度值（A450）。細胞生存率（%）＝處理組A值／對照組A值×100%。

1.2.4 流式細胞儀分析法測定細胞凋亡 以5×104／孔接種HepG2細胞于6孔板，待細胞貼壁后加入處理因素，60h后收集細胞，離心5min，去掉上清液，冷PBS輕柔沖洗1次，加入400μL緩沖液，加入10μL的Annexin V，避光于孵箱中孵化5min，再加入5μL的PI繼續孵化10min，上機檢測。

1.2.5 ELISA檢測細胞培養液中的bFGF－2表達情況 改用高糖無血清DMEM培養基培養細胞，于細胞對數期加入相應處理因素，繼續培養60h后提取各組細胞培養液。按照試劑盒說明依次操作，終止反應后，酶標儀測定A450，繪制bFGF－2濃度水平標準曲線。

1.2.6 Western－blot法檢測細胞中 Mcl－1的表達情況 取對數生長期細胞加入處理因素，60h后消化細胞，4℃、1 000 r／min離心5min收集細胞，加入細胞裂解液冰上裂解25min，提取總蛋白質，BCA比色法測定蛋白濃度，SDS－PAGE電泳（每孔上樣25μL）后經轉膜封閉1h，4℃一抗孵育過夜，在搖床上洗膜3到4次，加二抗常溫孵育1h，再次洗膜3次后用ECL發光法顯示成像。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析：兩兩比較，假定方差齊性LSD（L），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CCK－8檢測肝癌細胞抑制率結果 與對照組抑制率相比，索拉非尼各濃度組（1.5、3.0、6.0μmol／L）均能有效抑制肝癌細胞增殖，呈一定的時間－量效關系（F＝438.841，P＜0.05）。各用藥組約在60h到達平臺期。見圖1。

圖1 細胞生長抑制曲線

圖2 對照組的流式細胞分析

2.2 流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡結果 索拉非尼各濃度組（由低到高）誘導細胞早期凋亡率分別為（14.23±3.12）%，（35.28±3.98）%，（60.32±4.11）%，對照組早期凋亡率為（6.12±2.36）%。各組相比，高濃度的索拉非尼組更能誘導肝癌細胞凋亡（F＝1 404.051，P＜0.05），見圖2～5。

圖3 索拉菲尼1.5μmol／L組的流式細胞分析

圖4 索拉非尼3.0μmol／L組的流式細胞分析

圖5 索拉非尼6.0μmol／L組的流式細胞分析

圖6 各組Mcl－1蛋白質表達情況（Western blot）

2.3 各組細胞培養液中bFGF－2表達情況 對照組（252.85±5.32）pg／mL，索拉非尼1.5μmol／L組（190.13±6.88）pg／mL，索拉非尼3.0μmol／L組（130.36±4.45）pg／mL，索拉非尼6.0μmol／L組（45.31±4.19）pg／mL。各用藥組與對照組相比有統計學意義（P＜0.05），高濃度組效果優于低濃度組（F＝7 534.523，P＜0.05）。

2.4 各組Mcl－1蛋白質表達情況 在免疫印跡帶上，與對照組相比，高濃度的索拉非尼組的 Mcl－1表達明顯減少，而低濃度的索拉非尼組的Mcl－1減少相對較少。

3 討 論

本實驗結果表明，索拉非尼能導致肝癌細胞凋亡，差異有統計學意義（P＜0.05），其機制主要是在帶有致癌的K－ras和b－raf的突變體腫瘤細胞內，索拉非尼能夠抑制絲裂酶原活化蛋白激酶（MAPK）的傳導通路，從而干擾細胞周期［3］。同時，它阻斷Raf／MEK／ERK通路介導的信號傳導，還可以抑制多種受體酪氨酸激酶，包括新生血管有關的血管內皮生長因子受體（VEGFR－2、VEGFR－3）、血小板衍生生長因子受體、腫瘤生長相關的干細胞因子受體（C－kit）以及Fms樣酪氨酸激酶3（FIt－3）等［4］。而新近文獻報道 Mcl－1也是索拉非尼的靶點之一，其主要作用為誘導肝癌細胞凋亡［5］。Mcl－1是B細胞淋巴瘤／白血病－2基因（bcl－2）家族的一員，它的主要作用為促進細胞生存，抑制細胞凋亡［6］，且在肝癌組織的表達顯著高于癌旁組織，并與腫瘤大小，分級無關［7］。有學者認為bcl－2家族的高表達也是引起肝癌對常規抗腫瘤藥物易產生耐藥的主要原因之一，所以，索拉非尼下調 Mcl－1在對于多藥物聯合抑制肝癌方面有著更深遠的意義［8］。

bFGF－2屬于擁有廣泛促細胞分裂作用的bFGF家族。它們參與一系列生理過程，包括胚胎發育、細胞增殖、組織修復、腫瘤生長和浸潤［9－10］。在促進腫瘤生長方面的機制主要是由于bFGF作為一種細胞有絲分裂原和促血管生成因子，可直接作用于腫瘤細胞，使其分泌各種蛋白分解酶和膠原酶，從而促進腫瘤轉移和浸潤；另外，對活動期腫瘤，它明顯促進腫瘤血管的形成，并且通過腫瘤毛細血管內皮增殖，增加腫瘤血液供應，促進腫瘤細胞分裂［11－12］。bFGFS／bFGFRS信號轉導與腫瘤發生關系密切，多種腫瘤細胞過量表達bFGFR1和abFGF／bFGF，以bFGFR1和aFGF／bFGF過量表達為特征的自分泌信號環路是腫瘤惡性增生的首要條件［13－14］。臨床上，原發性肝癌患者服用索拉非尼后，血清bFGF－2表達明顯減少［15］，這與體外實驗結果相吻合。

綜上，索拉非尼能夠誘導肝癌細胞凋亡，并伴有 Mcl－1和bFGF－2表達下調。結合本實驗結果及相關文獻，提示 Mcl－1與bFGF－2在腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡過程中具有十分重要的作用，這對進一步揭示肝癌發生機制，發現新的肝癌診斷標志物及治療靶點均有重要意義。

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