坎地沙坦酯干預對AMI大鼠血管內皮功能及心肌ERK、CREB mRNA的影響

高電薩，秦 儉，蘭 莉，劉春艷，陳運貞

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院金山醫院心內科，重慶 401122；2.重慶醫科大學附屬第一醫院心內科，重慶 400016；3.四川省綿陽市第三人民醫院心內科 621000；4.重慶市九龍坡區第一人民醫院超聲科 400050）

內皮功能紊亂（endothelial dysfunction，ED）在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發生、發展的各個步驟均起著重要作用，可能與 ERK／CREB通路的改變有關［1－2］。有研究表明坎地沙坦酯（candesartan cilexetil，CAN）能保護高血壓患者和冠狀動脈支架植入術后動物的血管內皮功能，但目前尚未見AMI后ED的發生及CAN對此的干預效應。本文旨在探討AMI大鼠血管內皮功能和ERK／CREB信號通路的改變及CAN干預的影響，希望能為臨床AMI患者的內皮功能干預治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 CAN（重慶圣華曦藥業有限公司惠贈）；鹽酸去氧腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司）；氯化乙酰膽堿（上海三愛思試劑有限公司）；亞硝基鐵氰化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）放免檢測盒（解放軍總醫院科技開發中心）；一氧化氮（nitrous oxide，NO）檢測盒（南京建成生物科技研究所）；一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）檢測盒（南京建成生物科技研究所）；組織總RNA抽提試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）；RT－PCR試劑盒（上海寶生物工程有限公司）；生物機能實驗系統（型號BL－410，成都市泰盟科技有限公司）；新航肌肉張力換能器（型號JZ100，高碑店新航機電設備有限公司）；DFM－96型多管放射免疫計數器（合肥眾成機電技術公司）；721A型分光光度計（四川儀表九廠）；DYY－10C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；P×2型PCR儀（美國Thermo Hybaid公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物 健康SD大鼠30只（清潔級，雄性）。購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心［體質量（220±20）g，6～8周，許可證編號：SCXK軍2002008］。

1.2.2 造模 麻醉大鼠行氣管內插管，呼吸機人工呼吸，于左胸3～4肋間行縱切口開胸，分離心包暴露心臟血管，用5－0號無創絲線對冠狀動脈左前降支（LAD）進行結扎。假手術（sham－operation，Sham）組只穿線不結扎。

1.2.3 分組及給藥方案 將術后24h存活且經體表心電圖證實為AMI的17只大鼠隨機分為：AMI組（n＝8）和CAN組（n＝9），CAN組給藥劑量為3mg·kg－1·d－1。另設Sham組（n＝7）。研碎CAN原藥，予以0.5%羧甲基纖維素鈉助溶，配成混懸液，術后24h開始每日1次灌胃給藥，Sham組及AMI組給予等體積助溶劑灌胃，共干預2周。2周后各組存活大鼠數量分別為：Sham組6只、AMI組5只、CAN組7只。

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 血壓 分別在術前、術后24h（給藥前）、1周和2周（處死前）經大鼠尾動脈測量收縮壓。

1.2.4.2 血清NOS、NO水平 于術后2周時經眼眶后靜脈叢采血，分離血清，按試劑盒說明書采用化學法測定。

1.2.4.3 血漿 AngⅡ水平 采血方法同1.2.4.2，取血漿按試劑盒說明書采用放射免疫法測定。

1.2.4.4 胸主動脈條片離體灌流實驗 術后2周時將大鼠麻醉后開胸，迅速取出胸主動脈約2～3cm放入Kreb′s液中，Kreb′s液進行預冷處理并充以混合氣體（含95%O2、5%CO2），參照Gschwend等［3］的方法，分別檢測對去氧腎上腺素（phenylephrine，PE）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）及硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）的反應。

1.2.4.4.1 離體胸主動脈條片對PE的收縮反應 計算引起最強收縮效應50%的藥物濃度（EC50）和最強收縮效應（Emax），同時計算不同劑量下導致的收縮反應值與最強的收縮反應值的百分率。PE終濃度為10－10～10－4mol／L。

1.2.4.4.2 離體胸主動脈條片對Ach的舒張反應 以血管條片對累積濃度Ach舒張反應的幅度占血管條片對PE收縮幅度之比表示，同時計算引起最強舒張效應50%的藥物濃度（IC50）和最強舒張效應（Emax）。預收縮時所取PE濃度為10－5mol／L；Ach的終濃度為10－9～10－4mol／L。

1.2.4.4.3 離體胸主動脈條片對SNP的舒張反應 方法同1.2.4.4.2所述，SNP的終濃度為10－10～10－7mol／L。

1.2.4.5 測算MI面積 將AMI組和CAN組大鼠的左室橫切面制成石蠟切片后使用HE染色，制備病理切片。測量大鼠左室橫截面的內外周長和梗死區心肌的瘢痕組織弧長。

1.2.4.6 心肌ERK1mRNA、CREB mRNA 表達的檢測 于術后2周麻醉大鼠后開胸，迅速將左心室分離，取梗死區心肌組織，以 RT－PCR法檢測 ERK1mRNA、CREB mRNA的表達。表達水平以目的基因與內參的電泳條帶吸光面積積分比值表示。反應條件如下：ERK1引物序列：上游：ATC TCT GCT GCT GTG TCT TT，下游：ATG TTC TGT CAG GGA AAA TG，產物長度為180bp，退火溫度為55℃；CREB引物序列：上游：TAC CCA GGG AGG AGC AAT ACA，下游：GGT GCT GTG CGA ATC TGG TAT，產物長度為219bp，退火溫度為52℃；GAPDH引物序列：上游：AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA，下游：GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA，產物長度為515bp，退火溫度為55℃。

1.3 統計學處理 采用SAS8.2軟件進行分析處理，數據以±s表示。組間比較均采用成組設計方差分析，多重比較采用SNK－q檢驗。血壓比較采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血壓 在不同時間點對大鼠的收縮壓進行組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。術前Sham組、AMI組和CAN組收縮壓分別為（110.00±10.00）mm Hg、（110.80±11.45）mm Hg和（102.70±11.39）mm Hg，術后2周分別為（105.00±8.66）mm Hg、（108.60±11.39）mm Hg和（105.00±10.40）mm Hg。

2.2 血清NO、NOS、血漿AngⅡ水平 與Sham組比較，AMI組血清NO、NOS水平明顯降低，經CAN干預后，NO、NOS明顯升高，并恢復至Sham組水平。AMI組和CAN組血漿AngⅡ水平較Sham組均明顯升高；CAN組水平較AMI組顯著增高（表1）。

表1 3組大鼠血NO、NOS、AngⅡ水平比較

表1 3組大鼠血NO、NOS、AngⅡ水平比較

▲：P＜0.05，與Sham組比較；★：P＜0.05，與AMI組比較。

組別 n NO（μmol／L） NOS（U／mL） AngⅡ（pg／mL）Sham組6 55.69±10.40 23.80±5.36 181.39±32.70 AMI組 5 24.46±3.95▲ 10.92±5.96▲ 281.14±84.90▲CAN 組 7 43.69±13.32 17.74±3.97 388.27±83.24▲★

2.3 胸主動脈條片離體灌流實驗

2.3.1 胸主動脈條片對PE的反應 各組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。AMI組、Sham組和CAN組的EC50分別為（7.70±0.01）×10－8、（6.98±0.02）×10－8和（7.51±0.02）×10－8mol／L。見圖1。

圖1 主動脈條片對PE的收縮反應

2.3.2 胸主動脈條片對Ach的舒張反應 AMI組較Sham組明顯減弱，CAN組較AMI組顯著改善，但較Sham組仍然減退。Sham組、AMI組和CAN組的IC50分別為（6.15±0.03）×10－8、（4.45±0.21）×10－7和（2.32±1.22）×10－7mol／L，見圖2。

圖2 主動脈條片對Ach的舒張反應

圖3 主動脈條片對SNP的舒張反應

圖4 AMI組梗死區影像學表現（HE，×100）

圖5 CAN組梗死區影像學表現（HE，×100）

表2 3組心肌梗死面積及ERK、CREB mRNA表達的比較

表2 3組心肌梗死面積及ERK、CREB mRNA表達的比較

▲：P＜0.05，與Sham組比較；★：P＜0.05，與AMI組比較。

組別 n 心肌梗死面積（%）ERK mRNA CREB mRNA Sham組6 0 0.51±0.09 0.40±0.19 AMI組 5 20.68±1.29▲ 1.23±0.22▲ 1.15±0.30▲CAN組 7 13.23±1.02▲★ 0.83±0.19▲★ 0.87±0.20▲★

2.3.3 胸主動脈條片對SNP的舒張反應比較 各組間比較差異無統計學意義。Sham組、AMI組、CAN組的IC50分別為（8.40±0.00）×10－10、（1.50±0.00）×10－9和（1.27±0.00）×10－9mol／L。見圖3。

2.4 心肌梗死面積比較 經CAN干預后，心肌梗死面積顯著縮小。與Sham組比較，ERK、CREB mRNA在AMI組的表達明顯增加，CAN顯著抑制該表達。見表2、圖4～5。

3 討 論

ED廣泛存在于冠心病AMI病程發生、發展的各個環節，內皮依賴性舒張（EDD）功能異常為其特征。本實驗采用健康SD大鼠，通過結扎冠脈LAD制作AMI模型，結果顯示，與Sham組比較，AMI組大鼠血清NOS活性、NO水平均顯著降低，而血漿AngⅡ水平顯著升高，同時，AMI組離體主動脈對Ach的EDD反應明顯減弱，表明AMI導致了ED的發生。本研究同時還顯示，與Sham組比較，AMI后2周大鼠離體血管條片對PE的收縮反應和對SNP的非內皮依賴性舒張（nonendothelium－dependent diastole，NEDD）反應均無顯著性差異，表明AMI后2周血管平滑肌功能尚無明顯變化。

CAN是臨床上常用的ARB之一，能高度選擇性地阻止AngⅡ與ATlR的結合，從而拮抗AngⅡ對心血管系統的不良后果。目前已證實此藥穩定、有效的降壓作用，且可顯著改善冠脈內皮功能障礙患者［4］和冠脈支架植入術后豬EDD功能［5］，對抗動脈硬化的進展［6］，而有關此藥對AMI后血管內皮功能的保護作用如何目前尚未見報道。

本研究結果顯示，與AMI組比較，CAN干預后，血清NOS活性及NO水平顯著增高，離體胸主動脈條片EDD顯著改善（P均＜0.05），心肌梗死面積減小。與Sham組比較，CAN組血清NO、NOS水平差異無顯著性。換言之，CAN顯著改善后的內皮功能與Sham組相似。已有研究證實AT1R阻斷后可反饋性升高內源性AngⅡ水平，這與本研究結果一致，表現為CAN組血漿AngⅡ水平較其他兩組明顯升高。這可能與AT1R阻斷后AT2R活化，從而介導血管舒張效應有關。在AT2R高表達的血管平滑肌細胞中，血管緊張素誘導的血管舒張反應依賴于緩激肽2型受體和NO／cGMP系統［7］，表明緩激肽依賴性血流量介導的血管舒張反應是通過活化AT2R途徑實現的［8］。簡言之，CAN因高度選擇性地阻斷了AngⅡ與AT1R的結合，致血中AngⅡ水平反饋性升高，大量游離的AngⅡ與AT2R結合，激活緩激肽－NO級聯反應，從而使NOS活性增加，促進NO生成［9］。

目前，對ED發生的相關信號通路尚無定論，但有研究表明ERK／CREB可能與ED發生有關。就CAN對ERK／CREB通路的影響效應，已有研究表明它可顯著抑制由AngⅡ導致的細胞ERK活化［10］，但有關它在AMI后對ERK／CREB表達的影響效應目前尚未見報道。本實驗結果表明，與AMI組比較，CAN能顯著性抑制AMI大鼠心肌ERK mRNA、CREB mRNA的表達，故推測CAN可能通過阻斷AT1R而抑制ERK／CERB基因水平的活化，從而發揮抗炎、抗氧化應激、抗血管重塑等有害效應，達到保護內皮功能和縮小心肌梗死面積的作用。

與Perrone－Filardi等［11］的結果一致，在本實驗應用劑量范圍內，各組尾動脈收縮壓比較無顯著性差異，表明CAN對AMI后血管內皮功能的保護效應獨立于降血壓效應外。進一步研究AMI發生ED的信號轉導通路及CAN改善ED的分子機制，將為臨床更好地防治冠心病及發現新的治療靶點提供實驗依據。

［1］ Yada T，Kaji S，Akasaka T.Changes of asymmetric dimethylarginine，nitric oxide，tetrahydrobiopterin，and oxidative stress in patients with acute myocardial infarction by medical treatments［J］.Clin Hemorheol Microcirc，2007，37（3）：269－276.

［2］Jiang JL，Wang S，Li NS，et al.The inhibitory effect of simvastatin on the ADMA－induced inflammatory reaction is mediated by MAPK pathways in endothelial cells［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（1）：66－77.

［3］ Gschwend S，Buikema H，Henning RH，et al.Endothelial dysfunction and infarct－size relate to impaired EDHF response in rat experimental chronic heart failure［J］.Eur J Heart Fail，2003，5（2）：147－154.

［4］Iino K，Watanabe H，Iino T，et al.Candesartan improves impaired endothelial function in the human coronary artery［J］.Coronary Artery Disease，2012，23（4）：278－283.

［5］ Dohi T，Miyauchi K，Iesaki T，et al.Candesartan with pioglitazone protects against endothelial dysfunction and inflammatory responses in porcine coronary arteries implanted with sirolimus－eluting stents［J］.Circul J，2011，75（5）：1098－1106.

［6］ Suzuki T，Nozawa T，Fujii N，et al.Combination therapy of candesartan with statin inhibits progression of atherosclerosis more than statin alone in patients with coronary artery disease［J］.Coronary Artery Disease，2011，22（5）：352－358.

［7］ Tsutsumi Y，Matsubara H，Masaki H，et al.Angiotensin II type 2receptor overexpression activates the vascular kinin system and causes vasodilation［J］.J Clin Invest，1999，104（7）：925－935.

［8］ Bergaya S，Hilgers RH，Meneton P，et al.Flow－dependent dilation mediated by endogenous kinins requires angiotensin AT2receptors［J］.Circ Res，2004，94（12）：1623－1629.

［9］ De Gennaro Colonna V，Rigamonti A，Fioretti S，et al.Angiotensin－converting enzyme inhibition and angiotensin AT1－receptor antagonism equally improve Endothelial vasodilator function in L－NAME－induced hypertensive rats［J］.Eur J Pharmacol，2005，516（3）：253－259.

［10］Kiya Y，Miura S，Matsuo Y，et al.Abilities of candesartan and other AT1receptor blockers to impair angiotensin II－induced AT1receptor activation after wash－out［J］.J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2012，13（1）：76－83.

［11］Perrone－Filardi P，Corrado L，Brevetti G.Effects of AT1receptor antagonism with candesartan on endothelial function in patients with hypertension and coronary artery disease［J］.J Clin Hypertens，2009，11（5）：260－265.