ELISA檢測(cè)唾液中乙型肝炎表面抗原方法的優(yōu)化與評(píng)價(jià)

張 進(jìn)

（上海化學(xué)工業(yè)區(qū)醫(yī)療中心 200000）

中國(guó)是乙型病毒肝炎（HBsAg）的高發(fā)國(guó)家，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，人群發(fā)生率較高。表面抗原攜帶率約為15%［1］。乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)診斷對(duì)于其治療及預(yù)防有重要參考意義。目前，中國(guó)大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法來檢測(cè)HBsAg，而檢測(cè)樣品大多數(shù)均為血清。抽取靜脈血檢驗(yàn)，受檢者痛苦，且操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，存在一定風(fēng)險(xiǎn)，并不利于乙型肝炎疾病長(zhǎng)期臨床的檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)。有相關(guān)研究報(bào)道，唾液中可以檢測(cè)到乙型肝炎病毒［2］。然而，國(guó)內(nèi)并沒有特別針對(duì)唾液樣品的商品化試劑盒。雖國(guó)內(nèi)有相關(guān)研究報(bào)道，但方法條件不一，且特異度和敏感度均偏低。因此，本研究以唾液為樣品，對(duì)ELISA條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)改進(jìn)后的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 47例HBsAg血清陽性樣本均來自本院住院和門診患者，其中，男27例，女20例，年齡18～67歲，平均（40±12）歲。HBsAg血清陰性健康對(duì)照68例，均為來本院健康體檢人員，其中，男36例，女32例，年齡22～56歲，平均（38±8）歲，無乙型肝炎病毒感染史。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 購自上海科華公司，均在有效期內(nèi)使用。

1.3 取樣 受檢者靜脈采血2mL，分離血清，存于－20℃待檢。同時(shí)囑被檢者隨機(jī)吐唾液3mL，存于－20℃待檢。

1.4 檢測(cè)方法 血清檢測(cè)具體方法嚴(yán)格按上海科華公司提供的說明書進(jìn)行。唾液檢測(cè)具體方法除以下幾點(diǎn)外，均按說明書進(jìn)行，（1）樣品類型：①未處理樣本，1mL唾液樣本直接用于檢測(cè)；②樣本上清，將2mL唾液樣本12 000r／min離心5min取上清；③樣本沉淀，將上述離心后的沉淀用2mL蒸餾水重懸。（2）加樣體積：50、100、150μL。（3）樣品孵育條件：37 ℃，90 min；25℃，18h。

1.5 臨界值（cut－off value，CO）計(jì)算方法 方法1：CO1＝陰性對(duì)照OD450均值／3；方法2：CO2＝陰性對(duì)照 OD450均值＋3SD；方法3：使用 MedCalc統(tǒng)計(jì)軟件（version 9.2.1.0），利用ROC曲線計(jì)算曲線下面積（AUROC），判斷最優(yōu)臨界值CO3。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 血清樣品的HBsAg檢測(cè)結(jié)果作為評(píng)價(jià)優(yōu)化后ELISA方法用于檢測(cè)唾液樣品HBsAg的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)量資料采用表示，絕對(duì)變量比較采用χ2檢驗(yàn)；非絕對(duì)變量比較采用 Mann－Whitney U檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。唾液和血清檢測(cè)結(jié)果的一致性用κ指數(shù)評(píng)估。

2 結(jié) 果

陽性血清樣品的平均吸光值（OD450）為2.274±1.453，陰性血清樣品的平均吸光值（OD450）為0.017±0.026。未處理樣本、樣本上清和樣本沉淀這3種不同類型的樣品檢測(cè)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.100），結(jié)果如圖1所示。因此，不做任何處理的唾液樣品可直接用于檢測(cè)。不同加樣體積檢測(cè)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.070），結(jié)果如圖2所示。因此，加樣體積定為50μL。對(duì)50μL不做處理的唾液樣品在2種ELISA孵育條件（溫度、時(shí)間）下的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)25℃孵育18h條件下的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)血清檢測(cè)結(jié)果極為相似，而37℃孵育2h條件下的檢測(cè)結(jié)果與血清檢測(cè)結(jié)果差異顯著（P＝0.003），見圖3。

圖1 未處理樣本、樣本上清和樣本沉淀的檢測(cè)結(jié)果

由于目前暫無用于檢測(cè)唾液中HBsAg的商業(yè)化試劑盒，且唾液檢測(cè)在國(guó)內(nèi)醫(yī)院中并不常用，所以臨界值（cut－off value）的計(jì)算并沒有標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，通過對(duì)3種不同的臨界值計(jì)算方法進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示ROC法（CO3）最合適，臨界值為0.098。采用該方法后，精確度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均得到提高，分別達(dá)到93.0%、89.9%和95.4%，結(jié)果見表1。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取50μL不做任何處理的唾液樣品，采用25℃孵育18h的孵育條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果按照ROC曲線法判定。通過上述優(yōu)化后的ELLSA方法檢測(cè)，47例血清陽性對(duì)應(yīng)的唾液樣品中，44例為陽性；68例血清陰性對(duì)應(yīng)的唾液樣品中，63例為陰性。該優(yōu)化方法檢測(cè)唾液中HBsAg結(jié)果與對(duì)應(yīng)血清樣品結(jié)果見圖4。總之，血清和唾液樣品檢測(cè)結(jié)果的一致性比較高，κ指數(shù)為0.87。且該方法的特異度和敏感度分別為92.6%和93.6%。

圖2 3種不同加樣體積的檢測(cè)結(jié)果

圖3 37℃孵育2h和25℃孵育18h兩種孵育條件處理的檢測(cè)結(jié)果

表1 3種臨界值計(jì)算方法的敏感度、精確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和精確度

圖4 優(yōu)化后ELISA法檢測(cè)唾液中HBsAg結(jié)果與對(duì)應(yīng)血清樣品結(jié)果比較

3 討 論

唾液用于多種傳染病的抗體或抗原檢測(cè)具有方便性。有報(bào)道顯示，HBV攜帶者的唾液可能具有潛在的傳染性［3］。近年來有大量研究致力于唾液中肝炎病毒標(biāo)志物檢測(cè)方法的開發(fā)和優(yōu)化［4－6］。唾液取樣具有簡(jiǎn)單、快捷、低成本等優(yōu)點(diǎn)。因此，在部分血清流行病學(xué)檢測(cè)中，唾液取代血清作為檢測(cè)樣品將產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益［7］。本研究主要對(duì)ELISA檢測(cè)唾液中乙型肝炎表面抗原的方法進(jìn)行了優(yōu)化和評(píng)價(jià)。研究中發(fā)現(xiàn)，個(gè)別唾液檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品，對(duì)應(yīng)的血清檢測(cè)結(jié)果卻為陽性。這可能是由于該唾液樣品中HBV抗原濃度太低的原因。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)這些陽性血清樣品中HBsAg濃度很高（OD450＞3.0），表明唾液中 HBsAg濃度與血清中HBsAg濃度之間并無顯著相關(guān)性，該原因仍需進(jìn)一步研究。

由于目前暫無用于檢測(cè)唾液中HBsAg的商業(yè)化試劑盒，且唾液檢測(cè)在國(guó)內(nèi)醫(yī)院中并不常用，所以臨界值（cut－off value）的計(jì)算并沒有標(biāo)準(zhǔn)方法。3種不同的臨界值計(jì)算方法在其他研究中均有成功的報(bào)道［8－11］。因此，本研究對(duì)此3種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示AUROC分析法最為合理，可得到較高的敏感度和特異度。通過對(duì)其他條件（樣品類型、加樣體積、孵育溫度和時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，最終使該方法的精確度達(dá)到93%。

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