貴州3個地域苗族人群mtDNA 9bp序列缺失頻率＊

任凌雁，何 燕，張 婷，王嬋娟，王 歡，官志忠，單可人

（貴陽醫學院分子生物學重點實驗室，貴陽 550004）

貴州是一個多民族聚居的地區，有17個世居少數民族，其中苗族人口最多，占全國苗族總人口的50%左右。苗族人群線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）9bp序列缺失標記可能對追蹤該民族人群的親緣關系和遷移路線有所幫助。因為mtDNA 9bp缺失是一個非常有價值的多態性位點，其標準序列是2個串聯重復的9bp序列（CCC CCT CTA）［1］，有3種突變型：長型（標準序列前有4個C加入），短型（僅有單拷貝9 bp序列，即9bp缺失），3型（有3拷貝9bp重復）［2］。研究發現，mtDNA 9bp缺失是亞洲人及起源于亞洲的人種的特征［3］，其缺失頻率呈現的地理趨勢能很好地與史前該地區人類遷移路線相符，現將貴州3個地域苗族人群131例男性的mtDNA 9bp缺失頻率的檢測分析結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集來自貴州從江岜沙、黔西沙井、威寧龍街等3個地域苗族人群131例男性個體血樣，詳見表1。所選對象均為當地健康居民，家系3代內為同一民族，彼此之間無親緣關系。采樣符合知情同意原則。血樣均為EDTA－K2抗凝，－70℃暫存至提取基因組DNA。

1.2 DNA提取、定量及標化 按常規酚－氯仿法抽提基因組DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后取少量統一標化濃度為50 ng／μL，－20℃保存備用。

1.3 mtDNA 9bp的PCR擴增及PAGE檢測 依據mtDNA修訂的劍橋標準序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）［4］，用軟件 Primer Premier5.0設計引物 P1／P2（序列見表2）進行PCR擴增。25μL PCR反應體系組成為：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol／L MgCl21.5μL，4×dNTP（每種2.5 mmol／L）2.0μL，10μmol／L引物各0.4μL，DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 50ng。PCR循環條件：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次。PCR產物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染后觀察結果。

表1 3個苗族人群樣本概況

1.4 mtDNA 9bp分型結果測序驗證 隨機選取經PCRPAGE技術檢測為標準型和9bp缺失短型的樣本各5例，用引物P3／P4（序列見表2）進行PCR擴增，產物由北京鼎國昌盛生物技術公司完成序列測定。

2 結 果

2.1 PCR檢測結果 經過PCR－PAGE檢測，131例樣本的PCR反應產物的電泳圖譜中只檢測到2種基因型，分別為109 bp和100bp（圖1），分別對應標準型和9bp缺失的短型。

表2 引物序列及其他參數

圖1 mtDNA regionⅤPCR產物的PAGE電泳圖

2.2 序列測定結果 結果顯示：標準型擴增產物的核苷酸序列與相對應的劍橋序列一致，即存在2個串聯正向重復的9bp序列（CCC CCT CTA CCC CCT CTA），而9bp缺失短型擴增產物只有1個拷貝的9bp序列，即存在9bp缺失。見圖2（A、B均為反向測序圖）。

圖2 mt DNA Region V區序列分析結果（反向測序）

2.3 mtDNA 9bp缺失頻率 貴州岜沙、沙井、龍街3個地域苗族人群mtDNA 9bp缺失頻率見表3。

表3 貴州3個地域苗族人群mtDNA 9bp缺失頻率分布情況

3 討 論

姚永剛等［5］對中國多民族群體的研究發現，其缺失頻率由南向北、沿海向內陸呈現遞減的梯度分布。不同地區不同民族的mtDNA 9bp缺失頻率是各異的。本研究的3個苗族人群的缺失頻率與臺灣的高山族（41.46%）［5］相比較低，與廣州漢族的缺失頻率相近（20.8%）［6］，而較中原民族如河南漢族的缺失頻率高（15.88%）［7］。北方的一些少數民族，如現代羅布人（8.3%）［8］、維吾爾族（3.3%）［9］、塔吉克族（1.43%）［10］缺失頻率均比本研究的這3個民族低，差異經統計學分析已達到顯著水平（χ2＝8.845，χ2＝9.499，χ2＝23.324，P＜0.05），同一地區的不同民族其mtDNA 9bp缺失頻率是有區別的，如前期本課題研究貴州地區蒙古族（9.6%）、羌族（7.7%）［11］都低于本研究，并且差異有統計學意義（χ2＝8.280，χ2＝10.094，P＜0.05），水族［12］與本研究的苗族平均缺失率相近，而瑤族的缺失頻率高達58.2%［13］，高于本文的苗族平均缺失頻率，差異有統計學意義（χ2＝17.972，P＜0.05）；不同地區的同一民族其mtDNA 9bp缺失頻率也各異，廣西苗族缺失頻率為33.01%［14］，高于本研究，但差異無統計學意義。而貴州不同地區的苗族缺失頻率也是有所差別，本文3個地區的苗族缺失頻率就有所差異，其中從江岜沙苗族與黔西沙井苗族的差異有統計學意義（χ2＝5.623，P＜0.05）。苗族歷史悠久，由于戰爭、政治、經濟等原因，歷史上曾經歷過大幅度、遠距離、長時期的遷徙。自秦、漢時期有苗族先民進入貴州，經過唐、宋、元、明、清千余年的流動和遷徙，苗族的分布初步形成了今天的格局［15］。世居苗族主要分布在黔、湘、滇、川、桂、鄂、渝等10個省區，而貴州省已成為苗族的主要聚居區，人口占全國苗族總人口數的51.3%，是全省少數民族中人口最多的民族。苗族有自己的語言，屬漢藏語系苗瑤語族苗語支。苗語分3大方言，即東部方言、中部方言、西部方言。不同方言的人，語言互不相通。貴州從江屬中部方言的南部土語分支，貴州黔西屬西部方言川黔滇次方言，貴州威寧屬西部方言滇東北次方言，因此方言的隔離可能導致遺傳結構有所差異。此外，從江縣所在的黔東南苗族侗族自治州有眾多的苗族、壯族，而貴州的少數民族有著大雜居、小聚居的特點，所以從江苗族與黔西苗族、威寧苗族有差異，并且與黔西苗族的差異有統計學意義，推測可能是黔東南苗族與本課題前期研究的當地侗族（13.54%）（數據另行報道）有基因交流所致。總之，本次對貴州苗族人群mtDNA 9bp缺失頻率的研究有助于貴州苗族人群遺傳結構的組成，并進一步為貴州苗族的起源、遷徙過程奠定基礎。

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