妊娠期糖代謝異常與CAPN－10基因多態(tài)性及相關危險因素研究＊

周 龍，費 櫻，馬 莉，譚玉潔，3△

（1.重慶三峽中心醫(yī)院生化科，重慶 萬州 404000；2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室，貴陽 550001；3.貴陽醫(yī)學院附屬白云醫(yī)院檢驗科，貴陽 550014）

妊娠期糖代謝異常包括妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）和妊娠期糖耐量受損（gestational impaired glucose tolerance，GIGT）。有關研究資料表明，GDM與GIGT的總體發(fā)病率逐年升高，達7.6%［1］，其發(fā)生與遺傳、環(huán)境及生活習慣密切相關，但發(fā)病機制和病因至今還在研究之中。Hanis等［2］首次報道了CAPN－10基因與2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）連鎖不平衡。國內(nèi)外學者紛紛對CAPN－10基因與糖尿病的關系展開研究。目前，同時對GIGT、GDM與CAPN－10基因以及相關危險因素的報道較少。本文就貴陽地區(qū)漢族GDM、GIGT患者的CAPN－10基因19、43及63位點多態(tài)性進行研究，并探討與糖代謝異常發(fā)生相關的因素，以期為GDM、GIGT的發(fā)病機理研究提供實驗室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2009年10月至2010年11月在貴陽市婦幼保健院及貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院門診就診的孕婦，排除有孕前糖尿病史、慢性高血壓、內(nèi)分泌疾病、結締組織疾病、慢性肝病等系統(tǒng)性疾病，以及長期使用類固醇激素者，行50g葡萄糖負荷試驗（glucose challenge test，GCT）及75g口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）。采用相關的診斷標準將受試者分為糖耐量正常（normal glucose tolerance，NGT）組、GIGT組和GDM組，每組100例，均為漢族，年齡在25～35歲之間，對每位孕婦進行問卷調(diào)查，建立臨床資料，包括年齡、身高、體質量、受教育程度、孕次、自然流產(chǎn)次數(shù)、孕前體質量指數(shù)（body mass index，BMI，BMI＝體質量／身高2）、孕期體質量指數(shù)、孕期體質量指數(shù)的變化（即△BMI＝體質量的變化／身高2）、有無糖尿病家族史等。研究對象均符合倫理學要求，經(jīng)孕婦本人知情同意。

1.2 篩查程序及診斷標準 GCT以口服50g葡萄糖后1h血糖大于7.8mmol／L為異常，對異常者做OGTT試驗，采用葡萄糖氧化酶法測定血糖。根據(jù)樂杰主編的《婦產(chǎn)科學》第6版教科書標準，空腹12h后，口服葡萄糖75g，測空腹血糖（fasting plasma－glucose，F(xiàn)PG）及服糖后1、2、3h共4個時點的血糖即2h血糖（two hour plasma－glucose，2h－PG），正常值分別為5.6、10.3、8.6、6.7mmol／L，其中有2項或者2項以上超過正常值可診斷為GDM，1項異常者診斷為GIGT。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA提取方法 采用用酚－氯仿法提取基因組DNA，并測定DNA的純度和濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CAPN－10基因19、43及63位點基因型分析 （1）PCR引物序列：引物設計應用primer premier 5軟件，由北京賽百盛公司合成。PCR擴增反應體系：PCR反應體系25μL，其中 Taq DNA 酶2.5U、dNTPs 2mmol／L、PCR 染料2.5 μL、10×PCR Buffer（含 Mg2＋）2.5μL、上下游引物各10pmol及模板DNA 100ng。（2）PCR反應條件：19位點：94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)后72℃延伸7min；43、63位點退火溫度分別為59℃、64.5℃，其他同上。（3）PCR擴增產(chǎn)物的檢測：取上述PCR產(chǎn)物5μL，于3%瓊脂糖凝膠電泳后，在DNA成像分析儀下觀察目的條帶的位置。（4）CAPN－10基因的多態(tài)性檢測分析：19位點多態(tài)性是32bp的2次或3次重復多態(tài)性，其PCR產(chǎn)物可直接電泳分為3個基因型，即22純合子（404bp）、12雜合子（372 bp和404bp）、11純合子（372bp）；SNP 43、63多態(tài)性檢測采用聚合酶鏈式反應－限制性片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）方法。SNP 43位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)NsiI內(nèi)切酶37℃水浴6h酶切成121bp和23bp的2個片段，電泳后可出現(xiàn)GG型（144 bp）、GA型（144、121、23bp）和 AA型（121、23bp）3種基因型。SNP 63位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)HhaI內(nèi)切酶37℃水浴6h酶切成162bp和30bp的2個片段，電泳后可出現(xiàn)TT型（192 bp）、CT型（192、162、30bp）和CC型（162、30bp）3種基因型。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS11.5軟件進行數(shù)據(jù)處理。以Hardy－Weinberg平衡檢驗各位點基因頻率在群體中的代表性；計量資料的兩組間比較采用t檢驗，以表示；各組之間基因型和等位基因的分布差異采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；采用單因素和多因素Logistic回歸分析疾病發(fā)生的相關因素。

2 結 果

2.1 遺傳平衡定律檢驗 CAPN－10基因19、43、63位點的基因型頻率經(jīng)Hardy－Weinberg定律檢驗，均符合遺傳平衡法則，表明各基因頻率滿足遺傳平衡（P＞0.05），等位基因的分布具有群體代表性。

2.2 研究對象的臨床特征 與NGT組比較，GIGT組的孕期BMI、△BMI、FPG及2h－PG均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；GDM 組的年齡、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、FPG及2h－PG均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1；與GIGT組比較，GDM組的FPG、2h－PG均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 CAPN－10基因19、43、63位點基因型、等位基因頻率分布

2.3.1 CAPN－10基因19位點基因型、等位基因頻率分布與NGT組比較，GIGT、GDM組基因型及等位基因頻率的分布差異均無統(tǒng)計學意義；GIGT與GDM組的基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（表2）。提示CAPN－10基因19位點的長度多態(tài)性可能與GIGT、GDM的發(fā)病無關。

表1 研究對象的臨床特征

表2 CAPN－10基因19位點基因型、等位基因頻率分布

表3 CAPN－10基因43位點基因型、等位基因頻率分布

表4 CAPN－10基因63位點基因型、等位基因頻率分布

2.3.2 CAPN－10基因43位點基因型、等位基因頻率分布GG基因型頻率在GDM組較NGT組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；G等位基因頻率在GDM組較NGT組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；GIGT組與GDM組比較，其基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（表3）。

2.3.3 CAPN－10基因63位點基因型、等位基因頻率分布在NGT、GIGT和GDM組間兩兩比較，其基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（表4）。提示CAPN－10基因SNP 63位點可能與GIGT、GDM的發(fā)病無關。

圖1 NGT組、GIGT組及GDM組的孕前BMI、孕期BMI及△BMI比較

2.4 妊娠期糖代謝異常的相關危險因素分析

2.4.1 單因素Logistic回歸分析 對納入觀察的年齡、身高、體質量、受教育程度、FPG、2h－PG、孕次、自然流產(chǎn)次數(shù)、孕前BMI、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、SNP 43位點、SNP 63位點和19位點一共15個因素進行單因素Logistic回歸分析，篩選出年齡、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、SNP 43位點5個有意義的變量，結果顯示糖尿病家族史危險性最大，OR為7.232，其次為SNP 43位點，其余也顯示增加了患GIGT和GDM的危險性（表5）。

表5 單因素Logistic回歸分析結果

2.4.2 多因素Logistic回歸分析 以NGT組、GIGT組和GDM組為因變量，年齡、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史和SNP 43位點為自變量，建立多因素Logistic回歸模型。分析結果表明，在5個變量中，影響妊娠期糖代謝異常發(fā)病的危險因素從大到小依次為：SNP 43、糖尿病家族史、△BMI、孕期BMI、年齡。SNP 43的OR值最大，為8.105；其次為糖尿病家族史，為5.821，強烈提示SNP 43和糖尿病家族史增加了GIGT和GDM的危險度；其他包括年齡、孕期BMI、△BMI均與GIGT、GDM的發(fā)生具有相關性（表6）。

表6 多因素Logistic回 歸模型結果

續(xù)表6 多因素Logistic回歸模型結果

3 討 論

CAPN－10是calpain家族的一員，為細胞內(nèi)鈣依賴的半胱氨酸蛋白酶，存在于包括骨骼肌、肝臟和胰腺的許多組織中［3］，可參與細胞凋亡、增殖、分化等過程，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導，脂肪細胞分化以及胰島素誘導的胰島素受體1下調(diào)［4］。CAPN－10基因位于2號染色體長臂（2q37.3），該區(qū)域與T2DM連鎖不平衡，該基因存在多種SNP，其mRNA在胰、肌肉和肝臟中表達，它可能與胰島素分泌、胰島素作用和肝臟中葡萄糖的產(chǎn)生有關［5］，若基因發(fā)生變異時會出現(xiàn)胰島素的分泌和功能異常，導致胰島素抵抗的發(fā)生。

CAPN－10基因最初是由Horikawa發(fā)現(xiàn)的，他指出該基因的3個SNP（43、19、63）與墨西哥美籍人T2DM 關聯(lián)。其中SNP 43的G／G純合子顯著增加了罹患T2DM的危險度。Leipold等［6］對GDM患者及正常對照妊娠婦女的CAPN－10基因多態(tài)性（SNP 19、43、63）進行研究，結果發(fā)現(xiàn)該基因SNP 63位點C等位基因與GDM遺傳易感性相關，而與19、43位點無相關性。隨后Shaat等［7］對斯堪的納維亞婦女CAPN－10基因多態(tài)性進行研究，結果顯示這一地區(qū)的GDM婦女和正常妊娠者其SNP 43和SNP 44沒有顯著差別。田靜等［8］、羅毅平等［9］、周龍等［10］在對 CAPN－10基因多態(tài)性（SNP 19、43、63）的研究中發(fā)現(xiàn)，SNP 43位點多態(tài)性與GDM遺傳易感性有關，而與SNP 19、63則無關。同時，羅毅平等［11］通過對GDM患者脂肪及胎盤組織中CAPN－10mRNA的表達研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織該基因表達的減少可能是GDM患者胰島素抵抗的重要原因，而胎盤中該基因的表達則與GDM及其胰島素抵抗的關系不明顯。本研究結果顯示在CAPN－10基因19、63位點上，GDM組、GIGT組與NGT組的基因型頻率、等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義。而在43位點上，GDM組GG基因型頻率和 G等位基因頻率（92%、94.5%）明顯高于對照組（75%、87.5%），差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。這提示CAPN－10基因SNP 43位點多態(tài)性與GDM遺傳易感性有關，而與SNP 19、63位點可能與GDM的發(fā)生無關。這一結果與Leipold等［6］、Shaat等［7］的研究存在差異，但與田靜等［8］、羅毅平等［9］結論一致。這些研究結果之間的差異性表明，GDM的遺傳易感性存在著種族、地域的差異，同時GDM患者的多基因、多因素可能對CAPN－10基因的影響較大，可能GDM是多種遺傳和環(huán)境因素等共同作用的結果。此外，樣本的數(shù)量也可能對研究結果產(chǎn)生影響。

對于與妊娠期糖代謝異常發(fā)生有關的因素，國內(nèi)外已有大量研究報道。糖尿病家族史、高齡、肥胖是公認的GDM的高危險因素［12］，但仍有一些因素還在探討和研究中。遺傳因素在GDM的發(fā)生中起著相當重要的作用。余平芝［12］進行前瞻性研究中顯示，如果父母同時患糖尿病則孕婦妊娠期糖代謝異常發(fā)生的危險性較無家族史者增加9倍，而且家族中糖尿病患者越多以及與孕婦親緣關系越近，孕婦GDM發(fā)生的危險性越大。本次調(diào)查單因素及多因素非條件Logistic回歸分析結果中，糖尿病家族史的OR值分別為7.232和5.821，與GIGT、GDM發(fā)病呈正相關，表明糖尿病家族史是妊娠期糖代謝異常發(fā)生的高危因素。

由于肥胖者體內(nèi)脂肪對胰島素不敏感，產(chǎn)生胰島素抵抗及葡萄糖不耐受，使胰島素分泌過多，引起胰島素下調(diào)，增加糖尿病發(fā)生的危險性。而肥胖妊娠婦女在妊娠后期的胰島素抵抗及敏感性下降則更為顯著［13－14］。母體肥胖已經(jīng)是GDM較明確和公認的高危因素。有研究［15－16］顯示，超重、肥胖和嚴重肥胖者比正常體質妊娠婦女更容易發(fā)生GDM。本研究顯示，GDM組和GIGT組的孕期BMI、△BMI明顯高于對照組，本文還應用單因素及多因素Logistic回歸分析結果顯示孕期BMI、△BMI的危險性也大大提高（P＜0.01），也證明了肥胖可增加糖代謝異常發(fā)生的危險性，提示孕婦可通過飲食和運動等來控制體質量，以減少肥胖的發(fā)生，進而減少GDM的發(fā)生，因此，控制婦女肥胖也是預防GDM發(fā)生的重要因素。

由于妊娠期的糖代謝特點，妊娠本身具有促進糖尿病形成的作用。隨著年齡增長，糖尿病的發(fā)病率也增加。有研究顯示35歲以上的孕婦糖篩查異常率是25歲以下者的2～4倍，GDM發(fā)生率是5.5倍［17］。本研究通過單因素和多因素Logistic回歸分析OR值分別為1.275、1.027，P＜0.05，均顯示出孕婦年齡可增加妊娠期糖代謝的危險性。

人們的文化程度可決定其社會地位、自我保健意識等，可直接影響著人們的生活習慣、行為方式及精神狀況等方面。有調(diào)查研究［18］顯示文化程度與糖尿病的發(fā)病相關，文化程度高是糖尿病的保護因素，表明文化程度越高，發(fā)生糖尿病危險性越低。這可能與文化程度較高的人群，了解和掌握更多的預防保健知識，更注重身體健康和自我保健有關。目前，對于受教育程度與妊娠期糖代謝異常的關系報道不多，但在本研究中，多因素Logistic回歸分析結果未顯示受教育程度與GDM發(fā)病的相關性（P＝0.053，OR＝0.536），這可能與妊娠這一特殊的生理時期有關，也可能是與研究對象的樣本量有關，需要在今后的研究中進一步研究討論。

綜上所述，妊娠期糖代謝異常的發(fā)生是多源性的，是遺傳、社會及飲食等多因素多種環(huán)境共同作用的結果，同時，糖尿病的發(fā)生也與種族、民族及地域等相關。孕婦在孕24～28周進行糖尿病篩查是必要的，還應加強對妊娠期健康教育的大力宣傳，培養(yǎng)健康的生活方式、飲食習慣，適量運動和普及人群糖尿病預防及保健知識等綜合措施。同時，對具有高危因素的孕婦應重點監(jiān)護，指導其合理飲食，控制其體質量增長，對血糖密切監(jiān)測，并早期進行篩查，以減少妊娠期糖代謝異常的發(fā)生，減少對母嬰的危害。

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