布魯菌在Bact／Alert血培養儀上生長曲線特點

郭素芳，魏瑞霞，張 勇，福 泉，張軍力

2.內蒙古鄂爾多斯市準格爾旗人民醫院。

布魯菌是一種動物源性人畜共患病病原菌，可引起布魯菌病。臨床表現為多汗、反復發熱、關節痛、肝脾腫大。人類對布魯菌普遍易感。布魯菌病以皮膚接觸感染為主［1］，是牧業人員和某些職業人群感染布魯菌的主要途徑；其次，飲用生乳和食入污染布魯菌的食物而發生消化道傳染。臨床布魯菌主要分離自血液，由于此菌臨床分離較少，關于該菌在Bact／Alert血培養儀上生長曲線特點的研究極少見。本院于2011年4月—2013年1月從15例患者血液中分離出15株布魯菌，通過觀察布魯菌在Bact／Alert血培養儀上生長曲線特點，可幫助我們預測該菌株生長，協助臨床快速診斷布魯菌病。實驗室對布魯菌病的診斷有重要作用，從發熱布魯菌病患者的血液中或慢性感染患者的組織（如骨髓）中分離布魯菌是診斷該病的金標準［2］。

材料與方法

一、材料

（一）病例（菌株）來源 2011年4月—2013年1月從15例患者血液中分離出15株布魯菌，血清布魯菌凝集試驗均為陽性，診斷為布魯菌病，臨床上均表現有不規則發熱和動物接觸史。

（一）儀器與試劑 Bact／Alert 3D全自動培養儀及廠家配套血培養瓶購自法國生物梅里埃公司。

二、方法

（一）標本采集 無菌采集血液10 mL，注入中和抗生素的需氧瓶和厭氧瓶，經儀器掃描識別后，直接放進培養儀，培養儀自動進行檢測。

（二）實驗室鑒定 血培養儀需氧瓶陽性報警，觀察細菌生長曲線。注射器抽取血培養瓶中的樣本轉種到血平皿、巧克力平皿、麥康凱平皿35℃、5%CO2培養，并且進行尿素水解試驗及涂片。4 h內尿素水解試驗陽性，有布魯菌生長的可能性極大。涂片可見革蘭染色陰性球桿菌、染色很弱?？率先旧ㄊ氰b別布魯菌很好的方法［3］，布魯菌染成淡紅色，為球桿菌，其他細菌或細胞為綠色（或藍色），對比明顯。72 h血平皿及巧克力平皿上生長出較小、灰色、圓形、突起、邊緣整齊且不溶血的大小相同的小菌落，麥康凱平皿上無菌落生長。革蘭染色為陰性球桿菌、染色弱、細沙樣。15 min內尿素水解試驗陽性，氧化酶、觸酶、硝酸鹽均為陽性，吲哚為陰性。質控菌株為銅綠假單胞菌 ATCC 27853。2012年6月以前菌株未鑒定到種；6月之后的5株菌經VITEKⅡ鑒定為馬爾他布魯菌（Bruc.melitensis 97%），鑒定編碼100000130020100。對于血液、組織或無菌體液來源的陽性培養物，若該菌在血平皿上的菌落是小菌落、麥康凱平皿上不生長，氧化酶和觸酶為陽性，吲哚試驗為陰性，有上述生化反應特征，且2 h內尿素水解試驗為陽性的微生物應被推定為布魯菌，并應立即采取生物恐怖預防措施［4］。

結 果

絕大多數細菌是以二分裂方式繁殖，所以可以將生長和繁殖的整個過程分為遲緩期、對數生長期和穩定期［5］。繁殖速度快的菌種一般遲緩期較短，繁殖速度慢的菌種一般遲緩期較長。圖1a為本實驗室培養出金葡菌生長曲線，葡萄球菌屬細菌生長期曲線有一定的傾斜可見遲緩期、對數生長期及穩定期3個階段，生長期曲線角度較大；圖1b是本實驗室培養出布魯菌生長曲線，布魯菌遲緩期曲線較平坦，3 d左右陽性報警，生長期曲線短，穩定期曲線平坦；圖1c是本實驗室培養出大腸埃希菌生長曲線，腸桿菌科細菌遲緩期較短，生長期生長迅速，甚至無穩定期。

圖1 血培養葡萄球菌、布魯菌、腸桿菌科細菌生長曲線Figure 1 The characteristic growth curves of Staphylococcus aureus，Brucellaand E.coli in blood culture

討 論

布魯菌的生長曲線不同于腸桿菌科細菌、葡萄球菌，與不發酵糖革蘭陰性桿菌生長曲線相同。李新等［6］報道，不發酵糖革蘭陰性桿菌在血培養儀上生長曲線的特點是：生長期所對應的縱軸較短，遲緩期和穩定期曲線較平坦，陽性報警時間均值18.8 h。陳日榮等［7］觀察腸桿菌科細菌、葡萄球菌、不發酵糖革蘭陰性桿菌、鏈球菌屬細菌、腸球菌屬細菌及真菌的生長曲線，結果與李新等報道的相同，陽性報警時間均小于24 h。本院分離的15株布魯菌在Bact／Alert 3D血培養儀上的生長曲線與不發酵糖革蘭陰性桿菌的特點相同，陽性報警時間均值63.9 h，只有1株菌在36 h出現生長期，較其他14株菌生長期出現早。由此可見布魯菌的生長曲線特點雖然與不發酵糖革蘭陰性桿菌相同，但陽性報警時間較晚。有研究表明，在布魯菌流行地區使用血培養儀監測系統，大部分布魯菌在3 d內可獲得陽性結果［8］。內蒙古自治區是布魯菌病流行地區，本研究中15株布魯菌均在3 d左右檢出。如出現上述生長曲線時，應高度懷疑為布魯菌，后續的操作都應在生物安全柜中進行，轉種的平皿要延長培養時間，因大多數布魯菌在血平皿及巧克力平皿上需要48～72 h以上才能生長出肉眼可見的菌落。注射器抽取血培養瓶中液體直接進行尿素水解試驗，結合涂片革蘭染色細菌形態特點或柯氏染色可以提示布魯菌生長，比從平皿選取菌落進行上述試驗提前24～48 h。

用布魯菌診斷血清即可確定布魯菌，但不能鑒定到種。在選用治療藥物時可根據鑒定到屬的結果。鑒定到種和生物型水平有助于流行病學研究。通常不推薦進行布魯菌藥物敏感試驗，大多數布魯菌病治療失敗并非由于細菌耐藥［9］。

布魯菌侵襲力較強，可以通過黏膜、完整皮膚、呼吸道感染人類，在體內有很強的繁殖和擴散能力。由于布魯菌對人有極強的致病力，常可導致實驗室獲得性感染，被認為是潛在的生物恐怖病原菌，氣溶膠是實驗室獲得性感染的主要原因。實驗室感染可能與未在生物安全柜內處理陽性血培養標本有關。國外文獻有實驗室暴發感染的相關報道［10－11］。我國近年也有實驗室感染布魯菌的相關報道［12－13］。因此，必須嚴格遵守實驗室安全操作規程，處理感染性材料時，特別是處理布魯菌等具有高度傳染性的標本時，需要在3級生物安全防護下進行操作。實驗室工作者應認識到氣溶膠傳播的危險，適當使用生物安全防護，降低實驗室獲得性感染的風險。

［1］ 劉錫光.現代診斷微生物學［M］.北京：人民衛生出版社，2002：530.

［2］ 沈定霞.布魯菌感染的臨床特性及實驗室檢測［J］.中華檢驗醫學雜志，2012，35（1）：8－9.

［3］ 陳東科、孫長貴.實用臨床微生物學檢驗與圖譜［M］.北京：人民衛生出版社，2011：80.

［4］ CLSI.Abbreviated Identification and Bacteria and Yeast；Approved Guideline－Second Edition［S］.CLSI document M35－A2.Wayne，PA：Clinical and Labomtory Standards Instiute，2008.

［5］ 張穎悟，藍宏泰，鄭家齊.臨床微生物學［M］.大連：大連出版社，1990：21－28.

［6］ 李新，焦連亭，康淑荷，等.細菌在血培養儀上生長曲線的特點分析［J］.江西醫學檢驗，2003，21（4）：229－232.

［7］ 陳日榮，李惠冰，周美容.不同種類微生物在全自動血培養儀中的生長曲線特點及其意義［J］.中國感染控制雜志，2006，5（3）：206－208.

［8］ CLSI.Principles and Procedures for Blood Cultures；Approved Guideline［S］.CLSI document M47A.Wayne，PA：Clinical and Labomtory Standards Instiute，2007.

［9］ 徐建國，梁國棟，邢來君，等主譯.臨床微生物學手冊［M］.北京：科學出版社，2005：892.

［10］ Robichaud S，Libman M，Behr M，et al.Prevention of laboratory－acquired brucellosis［J］.Clin Infect Dis，2004，38（12）：e119－e122.

［11］ Fiori PL，Mastrandrea S，Rappelli P，et al.Brucella abortus infection acquired in microbiology laboratories［J］.J Clin Microbiol，2000，38（5）：2005－2006.

［12］ 張海艷，馬立憲，周艷麗.一例實驗室感染布魯氏菌病病例的流行病學調查［J］.首都公共衛生，2008，2（1）：38－39.

［13］ 王帝，翟璐.東北農業大學28名師生因動物實驗感染嚴重傳染?。跱］.中國青年報，2011－09－03.