廣東省東莞地區發現1株泛耐藥產KPC－2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

張 麗，張小兵，楊維青，黃 娟，張麗華，張菊芬，朱學海，朱凱欣，周 靜

肺炎克雷伯菌是醫院感染的常見病原菌之一，其耐藥的主要原因是細菌產生質粒介導的β內酰胺酶，主要是產超廣譜β內酰胺酶和質粒AmpC酶，有些菌株2種酶同時存在，導致對多種抗菌藥物耐藥［1］。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，出現了對其耐藥的肺炎克雷伯菌。國內報道臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌，其主要耐藥機制是產KPC－2型碳青霉烯酶，以華東地區報道的較多［2］。日前，我院在1例ICU患者的痰液中分離到泛耐藥產KPC－2β內酰胺酶的肺炎克雷伯菌，現報道如下。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來源 中山大學附屬東華醫院ICU患者的痰標本中分離到1株肺炎克雷伯菌。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、產KPC－2型的質控菌2105（由復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所胡付品博士惠贈）。

（二）主要儀器與試劑 VITEK2全自動細菌分析鑒定系統為法國生物梅里埃公司產品。藥敏紙片亞胺培南（10μg）、美羅培南（10μg）、阿米卡星（30μg）、左氧氟沙星（5μg）、環丙沙星（5μg）、哌拉西林（100μg）、哌拉西林－他唑巴坦（100－10 μg）、氨曲南（30μg）、頭孢他啶（30μg）、頭孢曲松（30μg）、頭孢吡肟（30μg）、頭孢西丁（30μg）、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑（1.25－23.75μg）及藥敏 MH培養基購自英國OXOID公司。PCR儀為美國ABI公司產品。DYY－6C型電泳儀、WD－9403C紫外儀為北京市六一儀器廠。細菌質粒提取試劑盒、PCR檢測試劑盒均為大連寶生物科技有限公司 產 品。引 物［3］blakpcF5′－GCT ACA CCT AGC TCC ACC TTC－3′blakpc R5′－ACA GTG GTT GGT AAT CCA TGC－3′由生工生物工程（上海）有限公司合成。

二、方法

（一）菌株分離與鑒定 按常規方法從臨床標本分離細菌，獲純培養后進行革蘭染色和氧化酶試驗，根據革蘭染色和氧化酶結果選擇革蘭陰性鑒定卡，在VITEK2全自動微生物分析儀上進行菌種鑒定，操作嚴格按照說明書進行。

（二）藥敏試驗 選用K－B紙片瓊脂擴散法，挑取一定量細菌配成0.5麥氏比濁的菌液，均勻涂布于MH平皿上，室溫干燥3～5 min。貼細菌藥敏紙片，各紙片中心大于24 mm，紙片距離平皿邊緣應大于15 mm。置35℃孵育16～18 h后讀取結果，參照 CLSI 2011年版標準判讀［4］。

（三）耐藥表型檢測 采用改良的Hodge試驗檢測待檢菌的耐藥表型［4］。用大腸埃希菌ATCC 25922以生理鹽水制備0.5麥氏標準菌懸液，按常規K－B法程序接種MH平皿，使平皿干燥5 min，在直徑90 mm平皿中央放置亞胺培南（10μg）紙片1張。然后使用10μL接種環挑取在血平皿過夜生長的3～5個試驗菌落，從紙片邊緣向外劃直線接種。劃線至少25 mm長，孵育24 h后，檢查 MH平皿，在抑菌環與試驗菌株交叉處是否出現增強生長。

（四）模板制備與PCR擴增及測序 煮沸裂解法制備模板DNA，PCR篩選KPC－2基因，所用引物及方法參照文獻［3］。PCR法擴增KPC－2基因的反應條件：預變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃1 min，共35個循環，再延伸72℃7 min，4℃保存10 min，即可電泳檢驗結果。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將1μL的核酸染料（將原液用0.5×TBE電泳緩沖液稀釋10倍）與5μL的Marker2000混勻取3μL加入凝膠孔中作參照；將1μL核酸染料、1μL的6×Loading buffer和4μL的PCR產物混勻取3μL上樣。110 V電泳35 min，溴化乙靛染色15 min，洗脫后放凝膠成像系統成象，觀察結果。以肺炎克雷伯菌ATCC700603作陰性對照，KPC－2陽性菌株2105作陽性對照。產物經純化、膠回收后由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，結果在GenBank網上查詢比對。

結 果

一、細菌鑒定和藥敏試驗

經鑒定該菌為肺炎克雷伯菌，細菌鑒定可信度99%。藥敏試驗結果顯示，除對阿米卡星敏感外，對亞胺培南 、美羅培南、哌拉西林－他唑巴坦和其他常用抗菌藥物均耐藥。

二、改良Hodge試驗檢測待檢菌的耐藥表型

大腸埃希菌（ATCC25922）抑菌環與痰標本分離到泛耐藥肺炎克雷伯菌在交叉處出現增強生長，而對照菌株在交叉處未出現增強生長。見圖1。

三、PCR擴增及測序

PCR產物GenBank Blast程序分析，該序列與KPC－2（GenBank11844849號）的核苷酸序列同源性為100%。PCR擴增檢測到KPC－2基因，序列長度為920 bp。見圖2。

圖1 產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌Hodge試驗結果Figure 1 Results of Hodge test for production of KPC－2 carbapenemase in Klebsiella pneumoniae

圖2 PCR產物電泳結果Figure 2 Results of electrophoresis for PCR products

四、臨床病史調查分析

該患者男性，52歲，因“鼻咽癌放療后17年余，咳嗽2 d，高熱1 d”入住我院ICU。入院診斷：①社區獲得性肺炎（重癥），急性呼吸衰竭；②血流感染（肺炎鏈球菌），膿毒性休克；③支氣管擴張。入院后予以嚴密監測生命體征，積極抗感染治療等處理，并行氣管插管、機械通氣治療。曾用頭孢他啶、哌拉西林－他唑巴坦、左氧氟沙星、亞胺培南等抗菌藥物。2012年3月8日，痰培養示泛耐藥肺炎克雷伯菌，予替加環素和阿米卡星抗感染，停用呼吸機，入住隔離病房，加強支持治療后，1個月內2次痰培養均未檢出肺炎克雷伯菌。

討 論

碳青霉烯類抗生素對革蘭陰性菌的抗菌譜廣，抗菌活性強，是治療醫院嚴重感染常用藥，尤其適用于產超廣譜β內酰胺酶或AmpC酶腸桿菌科細菌的嚴重感染。隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上廣泛使用，出現了耐藥菌株。目前，引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥的最常見原因是碳青霉烯酶的產生，尤其以產KPC酶最為常見。KPC酶最早在1株亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌中發現，是一種新型碳青霉烯酶，屬于Bush分類的A組2f亞組絲氨酸酶。此類酶能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素，克拉維酸對酶活性作用不確定［3］。目前發現11個KPC亞型，并在美國，特別是美國東北部各州蔓延，造成局部暴發和流行［5］；在我國，產 KPC－2酶的細菌以華東地區報道較多［2］。回顧東莞地區以往的耐藥監測數據，未發現耐碳青霉烯類的腸桿菌科細菌［6－7］。此次發現的1株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌經過PCR檢測，其耐藥基因及測序發現為產KPC－2型碳青霉烯酶，與我國其他地區報道的型別相同［2］。

碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌往往對臨床常用的抗菌藥物呈現耐藥。胡付品等［2］報道的中國CHINET2010年監測數據顯示，碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌除對阿米卡星和米諾環素的耐藥率分別為52.6%和37.0%外，對其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%～100%。Hirsch等［8］報道，治療由碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌引起的感染，可選用氨基糖苷類聯合黏菌素或替加環素的治療方案。本研究發現，該肺炎克雷伯菌除對阿米卡星敏感外，對其他測試抗菌藥物均耐藥。臨床根據藥敏結果改用替加環素聯合阿米卡星，并拔除氣管插管及對癥處理后，病情好轉，且1個月內連續2次痰培養均未檢出肺炎克雷伯菌。

Patel等［9］的研究表明，患者免疫狀態、入住ICU、長期住院以及廣譜抗菌藥物的應用是導致醫院內碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌感染或定植的危險因素。本次是在1例入住ICU，免疫功能低下的鼻咽癌化療患者中分離出該菌株，臨床依據實驗室結果合理應用抗生素及對癥治療后，細菌培養轉陰，也未引起醫院內播散。

因此，臨床依據藥敏結果合理使用抗菌藥物、加強醫院感染控制措施，可遏制耐藥菌株的產生和播散。

［1］ 胡付品，葉信予，吳培澄，等.2005年上海華山醫院細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2007，7（4）：332－337.

［2］ 胡付品，朱德妹，汪復，等.CHINET監測2010年碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌的分布特點和藥物敏感性［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（1）：1－7.

［3］ Smith Moland E，Hanson ND，Herrera VL，et al.Plasmid－mediated，carbapnem－hydrolysingβ－lactamase，KPC－2，in Klebsiella pneumoniaeisolates［J］.J Antimicrob Chemother，2003，51（3）：711－714.

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing［S］.Twentieth Informational Supplement，2011，M100-S21.

［5］ Woodford N，Tierno PM Jr，Young K，et al.Outbreak ofKlebsiella pneumoniae producing a new carbapenem—hydrolyzing class A beta－lactamase，KPC－3，in a New York Medical Center［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（12）：4793－4799.

［6］ 張麗華，張麗，李超強，等.東莞東華醫院2007年細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2008，8（5）：379－382.

［7］ 張麗，張麗華，張小兵.2009年中山大學附屬東華醫院細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2011，11（5）：375－380.

［8］ Hirsch EB，Tam VH.Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae carbapenemases（KPCs）：an emerging cause of multidrug－resistant infection［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65（6）：1119－1125.

［9］ Patel G，Huprikar S，Factor SH，et al.Outcomes of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae infection and the impact of antimicrobial and adjunctive therapies［J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2008，29（12）：1099－1106.