36株多重耐藥鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥基因的流行病學研究

邢麗丹，糜祖煌，徐鑫鑫，汪 汀，田莎莎，原鴻雁，張 盼，紀曉昀，蘇兆亮，許化溪

2.江蘇省無錫市克隆遺傳技術研究所。

鮑曼不動桿菌是一類醫院常見的不發酵糖革蘭陰性桿菌，屬條件致病菌。在人類，鮑曼不動桿菌可定植于皮膚、傷口、呼吸道和消化道，在免疫力低下時可感染機體發病［1］。近年來由于抗菌藥物的大量使用和各種侵襲性診療操作的實施，鮑曼不動桿菌的檢出率和耐藥率越來越高，甚至在一些科室呈暴發流行，引起了臨床和實驗室醫師的廣泛關注。鮑曼不動桿菌具有自動上調或主動獲得耐藥決定因子的能力［2］，其耐藥性正在逐年的增高，而且臨床感染多以多重耐藥菌株為主，對臨床治療帶來了極大的困難和挑戰。對于感染鮑曼不動桿菌患者的治療通常采用β內酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物，但隨著這些抗菌藥物使用的增加，耐藥菌株越來越多。為了解本地區鮑曼不動桿菌的流行和耐藥情況，本研究對江蘇大學附屬醫院和鎮江市第一人民醫院于2012年8—11月分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌的氨基糖苷類耐藥基因aac（3）－I、aac（6’）－Ib、aph（3’）和16S rRNA甲基化酶基因armA 進行了檢測，旨在為臨床氨基糖苷類抗生素的合理應用提供參考。現將結果報道如下。

材料與方法

一、材料

臨床分離的36株鮑曼不動桿菌均來自2012年8—11月江蘇大學附屬醫院和鎮江市第一人民醫院36例住院患者的臨床樣本，剔除同一患者同一部位重復分離的菌株。患者男26例，女10例，年齡9～93歲。樣本分布為：痰液34份，靜脈置管1份，腹水1份。

二、方法

（一）藥物敏感試驗 采用K－B紙片擴散法測定多重耐藥鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的敏感性，MH瓊脂和藥敏紙片分別為博賽生物科技有限公司和OXOID公司產品，以大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為質控菌株，并根據2010年版CLSL標準判斷藥敏試驗結果。

（二）細菌處理 挑選純培養菌落置入0.5 mL離心管內（內置50μL裂解液和蛋白酶K的混合物），PCR儀上55℃1 h（消化細菌菌體）后95℃10 min（破壞裂解液內的蛋白酶K），然后每管補充200μL純水，即為DNA模板液，置于－20℃冰箱保存備用。

（三）基因檢測 PCR法檢測氨基糖苷類耐藥基因，靶基因引物序列見表1。

PCR擴增體系為：每反應體系P1、P2引物各0.5μmol／L，dNTPs各200 mmol／L，KCl 10 mmol／L，（NH4）2SO48 mmol／L，MgCl22 mmol／L，Tris－HCl（pH9.0）10 mmol／L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1 u。總反應體積20μL（其中模板液5μL）。PCR擴增熱循環參數為：93℃預變性2 min，然后93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循環35個周期，最后72℃延長2 min。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結果。

（四）基因測序 PCR擴增產物在美國應用生物系統公司提供的ABI3730型毛細管全自動測序儀上測序，委托上海翰宇生物技術有限公司完成。

（五）序列比對分析 應用Chromas讀序工具軟件，測序結果用Chromas直接作BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST ）比對。

表1 靶基因PCR引物序列及終產物長度Table 1 Target genes and the primers used in PCR assay

結 果

一、藥物敏感試驗

多重耐藥鮑曼不動桿菌是指對5類抗菌藥物中的3類及以上耐藥，包括氨基糖苷類、β內酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類、碳青霉烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物。36株多重耐藥鮑曼不動桿菌的藥物敏感試驗結果見表2。

二、氨基糖苷類修飾酶基因檢測

氨基糖苷類乙酰轉移酶（acetyltransferase）基因aac （3）－1、aac （6′）－1b、磷酸轉移酶（phosphotransferase）基因aph（3′）－1和16S rRNA 甲基化酶（16S rRNA methylase）基因armA 均有不同程度的檢出，aph（3′）－1和armA 陽性率較高。氨基糖苷類修飾酶基因檢測結果見表3。

表2 36株多重耐藥鮑曼不動桿菌藥敏試驗結果［n（%）］Table 2 Results of susceptibility testing of the 36 multidrug－resistant strains of Acinetobacter baumannii［n （%）］

表3 36株多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類耐藥基因結果［n（%）］Table 3 The prevalence of aminoglycoside－resistant genes in the 36 multidrug－resistant strains of Acinetobacter baumannii［n （%）］

對4種基因的PCR擴增產物進行DNA測序，并進行BLASTn比對分析，結果與GenBank中已注冊的序列一致，同源性均≥99.0%。

討 論

鮑曼不動桿菌是典型的條件致病菌，在醫院特別是ICU常呈暴發流行［3］。鮑曼不動桿菌感染主要發生在免疫力低下的患者。常見的危險因素有長期住院尤其為長期入住ICU、多器官損害、中心靜脈或動脈置管的使用、導尿管的使用、輔助通氣、血液透析、急癥腹部手術、腸道定植、胃造口術或空腸造口術管的使用和先前使用過任何抗菌藥物等［1］。隨著鮑曼不動桿菌感染患者的增多，抗菌藥物的應用進一步導致了多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現。細菌對抗菌藥物的耐藥主要是由于耐藥基因表達的各類水解酶。目前用于治療鮑曼不動桿菌的主要抗菌藥物有5類，包括頭孢菌素類（頭孢他啶和頭孢吡肟等），碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南），酶抑制劑復方（哌拉西林－他唑巴坦），氟喹諾酮類（環丙沙星和左氧氟沙星）和氨基糖苷類（慶大霉素和阿米卡星）。多重耐藥甚至泛耐藥菌株的出現提示了菌株耐藥機制的多樣性。諸多文獻報道了鮑曼不動桿菌的不同耐藥機制。外排泵基因的表達在多重耐藥鮑曼不動桿菌中發揮重要的作用［4］。外排泵的5類超家族在鮑曼不動桿菌中最流行的是能夠外排很多抗菌藥物的RND泵的過表達，主要是AdeABC基因的過表達［4］，鮑曼不動桿菌Ade C能泵出的藥物包括β內酰胺類、氨基糖苷類、紅霉素、氯霉素、四環素類、氟喹諾酮類、甲氧芐啶和溴乙啶［5］。插入序列ISAbal的發現使碳青霉烯類、頭孢菌素類等耐藥基因高表達而導致鮑曼不動桿菌耐藥［3，6］。

氨基糖苷類抗生素對不發酵糖革蘭陰性桿菌、腸桿菌科及一些革蘭陽性球菌均有很好的抗菌活性，與β內酰胺類抗生素聯用有協同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。氨基糖苷類抗生素是通過抑制蛋白與16S rRNA合成和破壞細菌細胞膜的完整性的氨基環多醇殺死細菌［7］，其中主要耐藥機制是產生氨基糖苷類修飾酶［8－9］。氨基糖苷類修飾酶主要包括3類作用機制各不相同的酶：乙酰轉移酶修飾依賴于乙酰輔酶A的N－乙酰化，磷酸轉移酶修飾依賴于ATP的O－磷酸化，核苷酸轉移酶修飾依賴于ATP的腺苷化，降低了它們對核糖體亞單位的親和力［8，10］。氨基糖苷類修飾酶經常在流動元素中編碼，如質粒、轉座子和整合子，它們大都隱藏在不分類的額外的耐藥決定簇如ESBLs和MBLs中［8，10］。在鮑曼不動桿菌中，所有主要的氨基糖苷類修飾酶都有報道，用I類整合子編碼氨基糖苷類修飾酶的基因的存在在多重耐藥鮑曼不動桿菌中非常流行［11－12］。最近的研究報道了鮑曼不動桿菌中質粒介導的16S rRNA甲基化作用，這種機制可以使鮑曼不動桿菌對所有的氨基糖苷類抗生素耐藥［13］。氨基糖苷類抗生素通過作用于細菌核糖體30S亞基的16S rRNA高度保守的A位點，干擾細菌蛋白質的合成，從而引起細菌死亡，而質粒介導的16S rRNA甲基化酶能夠保護細菌的30S核糖體的16S rRNA不與氨基糖苷類藥物結合，造成對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥。

多重耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染患者常有基礎疾病，或曾接受廣譜抗生素治療。本研究36株多重耐藥鮑曼不動桿菌大部分來自ICU，其次有呼吸內科、老年科等。藥敏試驗結果反映了本組多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥情況相當嚴重，對亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率均在94.0%以上，對頭孢哌酮－舒巴坦的耐藥率相對較低（16.7%），可能是因為頭孢哌酮和舒巴坦聯合使用，舒巴坦抑制了β內酰胺酶對頭孢哌酮的破壞，增強頭孢哌酮的抗菌活性，而對慶大霉素的高耐藥率與氨基糖苷類耐藥基因有關［1］。armA為16S rRNA甲基化酶，有報道表明鮑曼不動桿菌的雙圈耐藥現象與armA基因誘導型表達有關［14］。氨基糖苷類耐藥基因在安徽合肥、浙江寧波、上海、山東泰安、天津、湖南岳陽、江西南昌等很多地區的鮑曼不動桿菌中廣泛存在［14－20］，與鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類酶的耐藥關系密切。本研究在一定程度上反映了鎮江地區鮑曼不動桿菌的耐藥情況比較嚴重，多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現提示該菌將是感染治療中的重點和難點。因此，合理使用抗菌藥物是控制耐藥菌醫院感染的重要手段，也是目前醫院感染研究的重要課題。

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