Flavopiridol聯合Bortezomib對多發性骨髓瘤的細胞增殖抑制作用

張 偉，董 理

（1.長春市中心醫院，吉林 長春 130051；2.中國醫科大學附屬第四醫院）

Flavopiridol聯合Bortezomib對多發性骨髓瘤的細胞增殖抑制作用

張 偉1，董 理2

（1.長春市中心醫院，吉林 長春 130051；2.中國醫科大學附屬第四醫院）

目的 探討細胞蛋白激酶抑制劑Flavopiridol及蛋白酶抑制劑Bortezomib在體內抑制多發性骨髓瘤細胞U266的細胞增殖作用及其機制。方法以不同濃度的Flavopiridol及Bortezomib分別、聯合作用于U266細胞，用MTT法檢測細胞增殖抑制作用。采用western blot法檢測Bcl-2及Mcl-1表達變化；結果 ①Flavopiridol比Bortezomib對U266細胞增殖抑制作用更強，IC50值分別為52.5nM，25nM。②與單獨用藥相比，Flavopiridol聯合Bortezomib作用于U266細胞，IC50值有明顯的下降為17.5nM。③Flavopiridol及Bortezomib給藥前后，Bcl-2蛋白表達無變化，而Mcl-1蛋白表達明顯下降。結論Flavopiridol聯合Bortezomib用藥能在體內明顯抑制多發性骨髓瘤細胞U266的生長，其機制主要是通過誘導細胞凋亡來抑制增殖。

多發性骨髓瘤；細胞蛋白激酶抑制劑Flavopiridol；蛋白酶體抑制劑Bortezomib；聯合用藥

（ChinJLabDiagn，2013，17：0817）

多發性骨髓瘤 （multiple myeloma，MM ）是漿細胞克隆性異常增生的血液系統惡性腫瘤［1］。其臨床特點是進行性的骨質破壞，骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、彌漫性骨質疏松等［2］。研究表明復發病例再次化療組與對照組治療成績差異無統計學意義，這與耐藥性有關，可嚴重影響患者的生活質量和預后［1］。

近年來，應用新的靶向藥物，其中小分子細胞周期蛋白激酶抑制劑Flavopiridol［3］，及蛋白酶體抑制劑Bortezomib（硼替佐米）［4］具有著良好療效。本文初步探討Flavopiridol及Bortezomib聯合治療對多發性骨髓瘤細胞的細胞增殖抑制作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Flavopiridol由美國Aventis公司提供，溶于二甲基亞砜（DMSO）中，濃度10mmol／L。硼替佐米（bortezomib）由本院提供，用生理鹽水稀釋至50 nM儲存。DMEM 培養液，胎牛血清，噻唑藍（MTT）。Bcl-2、Mcl-1 抗 體 （Sigma公 司），b-actin抗體及辣根過氧化酶（HRP）標記的抗鼠、抗兔二抗（Santa Cmz公司）。

1.2 細胞增殖抑制實驗

將U266細胞濃度調整為3×104個／ml，接種于96孔板，每孔100μl。培養24h后，實驗組分別加入不同濃度的（5、10、25、50、75、150、300nM）Flavopiridol及（0.01、0.1、1、10、25、50、100nM）bortezomib，對照組加入同等稀釋度的DMSO。每組設3個復孔，繼續培養，24h換藥，至48h終止培養，每孔加入 MTT（5g／L）20μl，繼續培養4h后離心，棄上清。加DMSO，200μl，避光振15min，在全自動酶標儀上測定570nmOD值，繪細胞增殖曲線、計算細胞生長抑制率及藥物的IC50值。

1.3 蛋白印跡（western blot）檢測

收集正常培養的細胞和經過bortezomib、Flavopiridol及聯合處理48h的細胞，裂解液裂解細胞后行聚丙烯酰胺凝膠電泳。每孔加樣20μg，轉移至PVDF膜上。用含體積5%脫脂奶粉的TBST（質量分數0.3%Tris，質量分數0.8%NaCl，質量分數0.02%KCl，體積分數0.1%Tween-20，pH＝7.4）封閉1h，加一抗（按說明書稀釋）4℃過夜（或室溫1h，視具體抗體而定）。TBST洗滌3次，每次8 min，二抗（辣根過氧化物酶標記，1∶3 000稀釋）室溫孵育1h。TBST洗滌3次，后顯色。

1.4 統計學方法

實驗數據以均值±標準差表示。多組間數據的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的Bortezomib及Flavopiridol分別對MM細胞增殖活力的影響

將不同濃度的 Bortezomib （0.01、0.1、1、10、25、50、100nM）及 Flavopiridol（5、10、25、50、75、150、300nM）分別處理在96孔板中培養的U266細胞，48h后通過MTT法檢測細胞的增殖活力，發現Flavopiridol比Bortezomib對細胞的生殖抑制性更強。IC50值分別為52.5nM，25nM。

2.2 不同濃度的Bortezomib聯合Flavopiridol對MM細胞增殖的影響

Bortezomib聯合Flavopiridol處理的U266細胞，以2：5濃度比在96孔板中培養，48h后通過MTT法檢測細胞的增殖活力，結果顯示：Bortezomib聯合Flavopiridol對U266細胞的IC50值為17.5nM（圖2）。三組 MTT相對IC50值比較，發現聯合用藥比單獨用藥的IC50值有明顯的下降（圖3）。

2.3 Flavopiridol對經Bortezomib治療的U266細胞的 Mcl-1、Bcl-2的蛋白表達水平的影響

圖1 A圖為Bortezomib對U266細胞的生殖抑制作用MTT圖，IC50為25nM。B圖為Flavopiridol對U266細胞的生殖抑制作用MTT圖，IC50為52.5nM

圖2 為Bortezomib聯合Flavopiridol對U266細胞的IC50值為17.5nM

圖3 為三組MTT實驗的IC50的相對值

Bcl-2在給藥前后均為陽性，且表達無明顯不同；而Mcl-1給藥前后也均為陽性，但其表達水平隨藥物的聯合應用而下降。該實驗重復3次，均取得近似結果，其中在β-actin表達一致的情況下，Bcl-2蛋白表達無變化，而Mcl-1蛋白表達明顯下降（見圖4）。

3 討論

我們采用 MTT法，觀察Bortezomib及Flavopiridol對U266細胞增殖的作用。結果顯示Bortezomib聯合Flavopiridol作用于MM細胞U266時，可更好的抑制其細胞的增殖，且濃度越高、時間越長，抑制作用越強。根據文獻顯示［6，8］：經過Flavopiridol高濃度給藥的細胞增殖抑制主要以細胞凋亡為主。

圖4 為Flavopiridol（FV）及Bortezomib（BT）單獨或聯合給藥（BT＋FV），Bcl-2和 Mcl-1的蛋白表達狀態

Flavopiridol不僅在單獨給藥時具有腫瘤細胞增殖抑制作用［9］，與其他藥物如Bortezomib聯合應用也能產生強大的協同抑瘤效應［7］。進一步探索Bortezomib聯合Flavopiridol誘導MM細胞凋亡的分子機制及其與其他多種因子的關系，為MM聯合治療提供新思路。

Bcl-2為膜蛋白，是細胞凋亡激活路徑中的主要調控基因。通過抑制腫瘤細胞凋亡，可延長腫瘤細胞生存時間，并對不同刺激誘導的凋亡有阻抑效應［10］。有 研 究 提 示，Bcl-2 可 參 與 Bortezomib及Flavopiridol誘導的細胞凋亡通路［11］，但發現給藥前后Bcl-2的表達無明顯變化。Mcl-1可能與Bortezomib、Flavopiridol誘導的細胞凋亡過程相關。Mcl-1是Bcl-2家族的一個抗細胞凋亡成員，Mcl-1與Bcl-2家族相互作用，通過細胞毒素的刺激抑制細胞凋亡［12］。在本研究中，抗凋亡蛋白 Mcl-1的蛋白表達明顯下降［13］，顯示 Bortezomib 聯合 Flavopiridol誘導U266細胞凋亡可能與Mcl-1相關，機制尚待進一步研究。以上結果表明，Bortezomib聯合Flavopiridol在體外能更好的抑制多發性骨髓瘤U266的細胞增殖，其主要機制可能為通過誘導細胞凋亡，來抑制細胞增殖［13］。

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The inhibitory effect of Flavopiridol in combination with bortezomib on the proliferation of multiple myeloma

ZHANG Wei1，DONGLi2.（1.ChangchunCentralHospital，Changchun130051，China；2.TheFourthAffiliatedHospitalof ChinaMedicalUnivercity）

ObjectiveTo discuss the protein kinase inhibitor Flavopiridol and proteasome inhibitor Bortezomi inhibition of multiple myeloma cells U266cell proliferation and its mechanism of action.Methodsdifferent concentrations of Flavopiridol and／or Bortezomib，respectively，the effects of U266cells proliferation was detected by MTT.By western blot to detect the expression of Bcl-2and Mcl-1，rearch the change of Bcl-xl，Mcl-1while U266was dealed with Flavopiridol and Bortezomib.Results①Compared with Bortezomib and Flavopiridol more proliferation of U266cells，（IC50：52.5nM，25nM）.②Compared with the drug alone，Flavopiridol and Bortezomib，while the role of U266cells with IC50values significantly reduced（IC50：17.5nM）.③Flavopiridol and Bortezomib before and after administration，the Bcl-2protein expression remained unchanged，while Mcl-1protein expression was significantly decreased.Conclusion

Flavopiridol and Bortezomib medication in the body significantly inhibited U266growth of multiple myeloma cells，and its mechanism is mainly inhibition of proliferation by inducing apoptosis.

multiple myeloma；the protein kinase inhibitor Flavopiridol；proteasome inhibitor Bortezomi；combined medication

R733.3

A

1007－4287（2013）05－0817－03

張偉，男，35歲，碩士，主治醫師，研究方向：骨關節與骨腫瘤基礎丐臨床研究。

2012－08－24）