RNAi靶向沉默c－FLIP(L)基因對大腸癌細胞凋亡的影響

杜亞平 張澤富 忽景泰 吳懷敏 謝建軍

1.廣東省珠海市第二人民醫院消化內科 519020 2.中山大學第五醫院影像科 廣東珠海 519000 3.廣東省珠海市第二人民醫院呼吸內科 519020

大腸癌是嚴重影響人類生存的常見惡性腫瘤之一，目前治療主要以手術為主輔以放療和細胞毒性藥物化療，但還有半數的病人死于再發和轉移［1］。通過RNAi的技術將C－FLIP的siRNA片段對大腸癌凋亡的影響，探究RNAi的靶向沉默C－FLIP基因在TRAIL介導的凋亡途徑中的作用機理，并期望使之成為大腸癌治療的新手段。

資料與方法

細胞株與試劑:人卵大腸癌細胞株，以及各實驗所需相關試劑。

實驗方法:①細胞實驗:用電穿孔技術把c－FLIP(L)對應的SiRNA片段轉染入細胞，半定量RT－PCR法判斷干擾前后FLIP mRNA水平的變化，Western blot分析FLIP蛋白水平變化，比較對應不同位點的兩個片段對的干擾效果經凋亡誘導型杭體激活后，以染色法及降解片段檢測分析干擾前后細胞對介導的凋亡敏感性的改變。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法及流式細胞術(FCM)檢測c－FLIP(L)－siRNA轉染前后TRAIL對SW480細胞生長抑制作用的變化。以Annexin－V－PI雙染法流式細胞術(FCM)比較c－FLIP(L)－siRNA轉染前后TRAIL誘導的細胞凋亡的情況。②動物實驗:通過構建脂質體介導的c－FLIP(L)－siRNA在脂質體(LipofectamineTm2000)介導下轉染大腸癌裸鼠移植瘤模型，將其分組。觀察c－FLIP(L)－siRNA對大腸癌裸鼠移植瘤的作用。具體方法，見圖1。

圖1 實驗方案流程圖

實驗分組:未做任何處理的大腸癌胞株SW480為空白組;轉染脂質體Lipofectamine2000的SW480細胞脂質體組;轉染NC－siRNA的SW480為陰性對照組;轉染c－FLIP(L)－SiRNA的SW480是FLIPL組。

統計學處理:應用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析處理，計量資料采用t檢驗，計數資料采用X2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

具體結果，見表1。

表1 轉染c－FLIP(L)－SiRNA后TRAIL對SW480胞株的凋亡作用

討 論

目前該大腸癌基因研究主要包括免疫基因治療、自殺基因治療、癌基因和抑癌基因的基因治療、抗癌血管生成基因治療、改善腫瘤化療療效的基因治療和聯合治療等［2］。現如今對大腸癌尚無肯定的基因治療方法，利用RNAi技術將c－FLIP(L)對應的SiRNA片段對大腸癌細胞株SW480凋亡的影響，明確RNAi靶向沉默c－FLIP基因在TRAIL介導的凋亡途徑中的作用，來指導臨床治療。

FLIP作為一種重要的凋亡抑制蛋白，可通過抑制caspase－8的活化來阻斷死亡受體通路，發揮凋亡抑制效應。C－FLIP與腫瘤的發生發展密切相關，阻斷caspase蛋白酶級聯反應，從而抑制Fas、TNFR－1、DR5、TRAILR 等死亡受體介導的凋亡。c－FLIP對由代謝抑制劑引起的翻譯受阻具有高度的敏感性。c－FLIP特異的代謝抑制劑處理后，可減小癌細胞的生存能力，提高其死亡率。以治療c－FLIP蛋白過表達的致命疾病隨著對c－FLIP分子調節機制的深入研究，以c－FLIP或其調節分子為靶點，對腫瘤及自身免疫性疾病進行基因治療研究，有了更為廣闊的前景。

1 白玉賢，劉磊，隋紅，等.miRNA干擾Pokemon基因對大腸癌細胞增殖的影響及機制［J］.臨床腫瘤學雜志，2011，16(11):970 ～973.

2 張孟賢，韓娜，于世英.RNA干擾沉默HDAC1基因對大腸癌細胞增殖和凋亡的影響［J］.世界華人消化雜志，2008，16(11):1173－1178.