乙型腦炎核酸疫苗的研究進展

王 鳳，湯德元*，曾智勇，馬 萍，李春燕，劉 霞，徐 健

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025，2、貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008）

乙型腦炎(Japanese encephalitis virus，JEV)，是由乙型腦炎病毒引起的傳染性疾病。該病對養豬業造成嚴重危害，尤其是近年來集約化養豬業發達的國家損失最為嚴重。雖然獸醫科研人員和養豬業者進行多方面的努力，采取了包括種源控制、疫病凈化、消毒隔離和早期斷奶等防治措施，但仍不能禁絕該病的發生和蔓延。目前預防乙型腦炎病毒感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗，但由于滅活疫苗存在注射劑量大，需多次注射，效果不穩定、免疫力不持久及副作用大等不足之處；我國研制的SA14-14-2株減毒活疫苗雖然保護性好，可以很好地刺激機體產生細胞免疫和體液免疫，但活疫苗畢竟是一種活的微生物，有可能出現毒力反強、帶毒、排毒、垂直傳播、核酸重組等現象，而且通過常規的血清學方法一般與自然感染無法區分。因此，人們在設法利用生物技術開發新型基因工程疫苗即核酸疫苗以克服現有疫苗的缺點，是當前研究的熱點，現將其進行如下綜述。

1 乙型腦炎病毒的基因結構及其核酸疫苗候選基因的選擇

1.1 乙型腦炎病毒的基因結構

JEV為單股正鏈RNA病毒，全長約11kb，整個基因組由5′端非編碼區(5′-NCR)和1個幾乎跨越整個基因組的單一開放閱讀框(ORF)和3′端非編碼區( 3′-NCR)構成。編碼3個結構蛋白：C蛋白(衣殼蛋白)、PrM/M(膜前體蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)以及7個非結構蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，各基因在基因組上的排列順序為：5′ -C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。

1.2 乙型腦炎病毒核酸疫苗候選基因的選擇

PrM蛋白是未成熟病毒體的一部分，在病毒感染后期，它在被水解為M蛋白后而發育為成熟的病毒體。PrM蛋白存在感染細胞內未成熟的病毒粒子中，在JEV感染的最后階段，水解成M蛋白。然而，在有些情況下，PrM的剪切可能不完全，結果使PrM蛋白成為毒粒上能產生中和抗體的附加靶位，免疫含PrM/E的胞外顆粒可產生中和抗體和保護性免疫；表達PrM蛋白或E蛋白的重組痘苗病毒免疫小鼠和豬，可有效保護JEV的攻擊[1]。而且，JEV糖蛋白容易分泌和表達在細胞表面，這些是其作為有效免疫原的重要決定因素。M蛋白是完全疏水的，參與病毒囊膜的構成，是病毒囊膜主要結構成分之一，被包埋在囊膜的脂質雙層中，它可能與插入脂雙層的E蛋白完全疏水性C端相互作用，對維持E蛋白空間結構是必需的。Takegami等(1982)對其生物學功能進行了研究，認為M蛋白參與病毒的感染過程，PrM蛋白是病毒誘發保護性免疫的重要協同成分，M蛋白能誘生具有輕度中和作用的抗體。

E蛋白全長由500個氨基酸殘基組成，分子質量約為53 kD，富含Gly和Ala，Pro含量低，是疏水性的，僅有一的糖基化位點在多數黃病毒中具有保守性。E蛋白含有病毒血凝素和中和抗原決定簇，為黃病毒屬中的主要結構蛋白，是主要抗原成分，在誘導機體產生有效的中和抗體及保護性免疫中起重要作用[2]。此外，E蛋白還與細胞膜受體相結合并與細胞膜融合而使病毒進入細胞，與病毒的吸附、穿入、致病性、組織嗜性、血凝反應、血清特異性和誘導宿主的免疫應答等作用緊密相關。E蛋白上相關位點的氨基酸變異，對JEV神經毒力及神經侵襲力有著重要的影響。另外，JEVE蛋白還是引起宿主機體免疫及產生中和抗體的主要抗原蛋白，由它形成表面抗原決定簇，具有血凝活性和中和活性，能刺激機體產生中和抗體，保護機體免受病毒攻擊。

NS1蛋白是一種分泌型糖蛋自，其分子質量為40kD，但由于在130位和207位存在N-連接糖鏈，在感染細胞內其實際分子質量為46 kD左右。Mason等(1989)用E.coli來表達JEV抗原，證實在JEV感染的細胞中NS1蛋白以NS1和NS1′2種形式存在，NS1和NS1′在N末端具有相同的序列，NS1′在C末端還存在一段高度疏水的氨基酸序列，該段序列由基因組的NS2a基因編碼。NS1分子質量約40kD，NS1′為58 kD。由于NS1和NS1′存在相同的N末端，故有相同的抗原性和生化特性，NS1′是主要的病毒產物，而不是在NS1產生過程中短暫存在的。在細胞培養液中NS1的量大，可能是因為NS1比NS1′更有效地分泌到細胞外或NS1′在釋放過程中被降解為NS1。NS1蛋白特異性免疫探針與JEV感染細胞結合的結果說明，其分泌于感染細胞表面。另外，感染細胞還分泌可溶性的NS1。在NS1′C末端存在一段高度疏水的氨基酸序列，使NS1蛋白存在于細胞表面成為可能。Mason等在TritionX-100存在的情況下通過超速離心發現，NS1蛋白的沉降特征發生了改變，說明NSl蛋白與膜相互作用結合在一起。NS1在感染細胞的表面表達，細胞外分泌，不但在黃病毒的感染過程中可引起免疫性反應，而且這種抗體在實驗動物體內可起保護作用，這個保護作用依賴抗體的Fc部分，因為NS1專一性抗體通過補體依賴途徑殺傷感染的靶細胞[3]。NS1蛋白不組成毒粒，沒有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性補體結合活性，它可在不出現中和抗體的情況下誘生保護力，且不產生抗體依賴性增強，加之NS1的基因和表型具有高度同源性。有學者認為黃病毒NS1作為亞單位疫苗比滅活疫苗有優勢[4]。

2 乙型腦炎病毒核酸疫苗研究進展

2.1 有關PrM、E基因核酸疫苗的研究

Ashok MS等[5]構建了編碼JEVE蛋白的DNA質粒PCMXENV，經鼻腔和肌肉途徑接種瑞士小鼠后，進行JEV腦內接種攻擊試驗，結果顯示：該重組質粒對攻擊感染有一定的保護作用，免疫鼠血清中未能檢出抗JEV抗體，但產生了低水平的JEV特異性T細胞增殖。后來其又將E蛋白的全長基因序列和氨基端398個氨基酸的基因序列分別克隆到表達載體發現：只有后者能產生分泌性表達；而且與其他DNA疫苗比較，后者可誘導Th1和Th2的增殖反應，在小鼠能產生最高水平(71%)的抗攻擊保護。E基因全長DNA疫苗在小鼠體內只能誘導低水平的中和抗體，認為保護作用可能主要與細胞免疫有關[6]。

Konishi等 (1998)以 pcDNA3.1為載體構建了含JEV中山株前膜信號肽(S)、PrM、E基因cDNA的重組質粒pcDNA3.1JEME，將此質粒100μg肌注小鼠，間隔2周再注100μg，2～3周之后采血測定中和抗體，滴度為1∶640，用P3株l04ID50腹腔攻擊，100%(5/5)存活，若用10pg質粒，中和抗體為1∶320，存活率100%，免疫持久性至少為6個月。

Chang等[7]構件了表達PrM和E蛋白的質粒DNA，由巨細胞病毒立即早期基因啟動子控制，將該質粒導入COS-1細胞，COS-1細胞向培養液中分泌細胞外病毒樣顆粒，用這種DNA疫苗免疫雌性小鼠，產生中和抗體滴度在1∶20到1∶160之間，用5 000 PFU強毒株SA14腹腔注射攻毒，對其子代的保護率在40%到100%之間。免疫7周齡的成年小鼠，3 d后用5 000 PUF強毒株SA14攻毒，小鼠得到完全保護。Chang等的研究表明，所有接種1次JEV DNA疫苗的小鼠體內可產生JEV特異性的抗體，且至少維持18個月。3周齡小鼠免疫后100%血清抗體陽轉，中和抗體效價達1∶20～1∶160。獲得100%的動物保護。

Chen(1999)等利用真核表達載體分別重組構建了JEVE蛋白以及其他蛋白基因片段，通過比較上述重組質粒在分別免疫動物后所產生的中和抗體效價與保護性免疫效果，發現含JEV E蛋白編碼基因的質粒DNA所致的中和抗體效價以及保護性免疫結果明顯優于其他蛋白基因片段，用編碼JEV E蛋白的質粒免疫小鼠，與滅活疫苗比較，結果產生了更持久和更強的JEVE蛋白特異性抗體，且對JEV的致死攻擊具有高度保護作用。

Konishi等[8]構建了2株基于PrM和E基因的DNA疫苗，并進行了免疫試驗。結果表明以100～450 μg劑量間隔3周對豬進行二次免疫，免疫后第1周即產生HI抗體和中和抗體，并可維持245 d的高滴度HI抗體水平。試驗還證明當以PrM/E質粒DNA疫苗免疫小鼠后，取其脾細胞在體外刺激后可檢測出CTL活性，而血清中未能檢測出中和抗體。但當小鼠接受JEV攻擊后，由于DNA免疫小鼠存在記憶性B細胞和T輔助細胞，中和抗體的滴度迅速上升，并足以保護小鼠抵抗JEV的攻擊。他們認為這也許是免疫動物獲得保護的機制。Konishi等還發現含病毒PrM與E蛋白編碼基因的重組質粒DNA在免疫動物后不僅誘導出特異性的CTL細胞參與細胞免疫反應，而且可產生特異性B細胞參與體液免疫反應，進一步研究還發現在免疫動物體內產生的中和抗體的效價與所維持時間都明顯高于普通滅活疫苗的免疫結果，說明了DNA疫苗在預防JEV感染方面的試驗研究的可行性。

據報道，基因槍免疫所需的DNA量僅為肌注免疫所需量的1/100～1/200，就可獲得相近的抗體反應。Chen等的研究結果不但證實這一結論，而且認為不同的DNA免疫途徑產生的抗體亞型和親和力也不同。

Kaur R等[9]用合成分泌型或膜錨定型JEV的PrM和E蛋白的質粒經肌注或基因槍接種小鼠發現：E蛋白的2種表達類型均能誘導較高的中和抗體滴度，而肌注較基因槍方法能誘導更高水平的抗E抗體反應；認為肌注可能誘導以Th1為主的免疫反應，而基因槍接種誘導Th2為主的免疫反應；在小鼠對JEV腦內接種的攻擊感染可提供60%的保護。

Mohammad[10]等以小鼠作為模型，用抗原提呈細胞和巨細胞病毒對JEVE蛋白的表達進行免疫調節，并采用免疫熒光法和Western印跡檢測，結果抗原提呈細胞和巨細胞病毒都能刺激小鼠產生的抗體滴度增加，但是巨細胞病毒刺激小鼠產生的抗體滴度更高。更重要的是，由原提呈細胞啟動執導的免疫反應偏向Th1型。

prM基因和E基因，分別在N-15和N-154的位置有一個潛在的N-糖基化位點，Yu Zhang等分別在prM基因和E基因的N-連接糖基化位點進行突變處理來構建DNA疫苗，該DNA疫苗免疫小鼠的結果表明，E基因N-154糖基化位點突變的DNA疫苗能使小鼠分泌IL-4的水平升高和產生更大滴度IgG，獲得完全保護。因此，E蛋白N-154糖基化位點突變能增強誘導體液免疫應答，表明這種突變可作為針對乙腦潛在的DNA疫苗。

2.2 有關NS1基因核酸疫苗的研究

Lin等用編碼JEV PrM/E、NS1基因的質粒DNA皮下接種小鼠，結果發現，編碼PrM/E蛋白的質粒DNA免疫小鼠攻擊強毒后有70%的小鼠受保護，而用編碼NS1的質粒免疫小鼠，強毒攻擊后可獲得90%的保護。NS1質粒免疫的小鼠雖未檢測到中和抗體，但對乙腦病毒感染的細胞在補體參與條件下有很強的溶解細胞作用。用C末端多出60個氨基酸的NS1核苷酸序列(NS1′)的質粒免疫小鼠卻經不住強毒的攻擊。生化分析表明，NS1很容易分泌大量的同型二聚體并表達于細胞表面，NS1′卻不能，且NS2a會下調NS1基因疫苗的效果。不管是用抗NS1單抗被動免疫，或者是用NS1蛋白主動免疫，均證明黃病毒NS1具有激發保護性免疫的表位，證實NS1足夠引發保護性免疫。然而，早期許多學者以痘苗病毒、Sindbis病毒和桿狀病毒等重組病毒為載體的研究表明，JEV的NS1只能對宿主產生低水平的保護作用。這種差異可能由于使用不同的表達系統和不同的NS1序列。也有可能是在病毒載體的存在下，NS1只能作為很弱的免疫原或多余的NS2A的一些序列可能是導致NS1不能產生有效免疫保護的原因，這些結果與以往對登革熱的研究結果相符，重組痘苗病毒含登革熱NS1可完全保護登革熱病毒的攻擊，但在NS1加上15%的NS2a序列后，就不能獲得相似結果。

使用核酸疫苗進行免疫既能消除在活疫苗制備中存在的不必要抗原所致的免疫應答，又不必顧慮感染因子所帶來的諸多問題，而且能夠誘導廣泛的體液與細胞免疫應答，有助于產生高水平保護性免疫[11]。但核酸疫苗效力的好壞也取決于許多因素，如抗原自身的特性、免疫途徑、是否使用佐劑或使用佐劑的類型等，所以現在人們對影響核酸疫苗效力的各種因素展開了研究[12]。如果核酸疫苗潛在的安全性和接種方法能夠得到解決和改進，將具有很大的開發潛力和應用前景。

[1] 湯德元，王鳳，馬萍，等.乙型腦炎病毒貴州分離株E基因原核表達及其免疫原性的研究[J]. 畜牧獸醫學報，2012，43(8)：1330-1336.

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[3] 王鳳，湯德元，李春燕，等.日本乙型腦炎病毒NS1基因及其疫苗的研究進展[J].中國動物保健，2012，14(12)：16-19.

[4] 李春燕，湯德元，徐健，等.乙型腦炎的發病機理及毒力致病機理的研究進展[J].中國獸藥雜志，2008（4）：41-43，53.

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[12] 王鳳，湯德元，羅險峰，等.日本乙型腦炎病毒貴州分離株NS1基因克隆及表達載體的構建[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2013（4）：90-93.