豬源乳酸桿菌齊市地方株的分離與種屬分析

邱景會

（黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

豬用益生菌制劑可調節豬腸道內微生態平衡，對宿主動物產生益生作用。我國臨床應用的微生態制劑菌株大概有6 種，即乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌和酵母菌[1-2]。其中以乳酸桿菌最為常用，該菌為仔豬腸道正常微生物區系中的優勢菌群，可利用糖類發酵產生大量乳酸，有的還產生乙酸及其他揮發性脂肪酸，對致病菌具有很好的抑制作用，對維持仔豬腸道微生物區系平衡和消化機能起著重要作用[3-4]。

由于豬的品種不同，養殖地域不同，優勢菌群也有差異。選擇特異的優勢菌株是研制豬用益生菌制劑的關鍵。所以，本研究擬從齊齊哈爾周邊地區健康仔豬腸道中分離篩選出豬源特異性乳酸桿菌，用來研制豬用微生態制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品

在齊齊哈爾市龍江縣，甘南縣，富裕縣及泰來縣等地區相關豬場，選定21～35 日齡長白、大白、杜洛克、二元及三元雜交健康仔豬，用滅菌棉簽蘸取新鮮糞樣，置于滅菌EP 管中，共采集糞樣15 份。送至實驗室進行細菌分離。

1.1.2 試劑和設備

MRS 瓊脂和MRS 肉湯（北京陸橋技術有限責任公司），細菌生化鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司），電子天平，恒溫培養箱，超靜工作臺。

表1 乳酸桿菌屬鑒定結果

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品處理

將采集的仔豬糞樣置于裝有50 mL滅菌生理鹽水含玻璃珠的錐形瓶中。將錐形瓶置于搖床振蕩5 min（160 r/min），然后將原液進行10 倍系列稀釋，自10-1至10-9，共9 個稀釋度。

1.2.2 菌株分離、染色和鏡檢

分別取10-7至10-93 個稀釋度的糞樣混懸液各0.l mL 涂布于MRS 平板，37 ℃恒溫厭氧培養24～48 h。挑取各種不同菌落進行革蘭氏染色如圖1，鏡檢，觀察菌體形態。

圖1 嗜酸乳桿菌革蘭氏染色圖片

1.2.3 菌株的純化

挑取疑似菌落進行純化，記錄并觀察菌株形態特征。

1.2.4 分離菌株的生理生化鑒定

按照乳酸桿菌屬和種的生理生化鑒定指標[5-6]，分別進行厭氧生長試驗、運動性試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶試驗、吲哚試驗。若厭氧生長試驗為陽性，其他均為陰性，可初步定為乳酸桿菌屬。再進行糖醇類發酵產酸試驗（阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸鹽、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、松三糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、七葉苷、水楊素），結果與《伯杰細菌鑒定手冊》對照，從而進行乳酸桿菌種的鑒定。

表2 乳酸桿菌種間生化鑒定結果

2 結果

2.1 菌落形態特征

通過厭氧分離純化，共獲得革蘭氏陽性，無芽孢桿菌12 株，其中菌株SY1 和SY2 菌落形態基本相同，均為圓形、邊緣不整齊、表面粗糙、扁平、灰白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm；菌株DYF3 和DYF4 為圓形、邊緣整齊、表面光滑、白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm。

2.2 染色特性

對分離出的所有菌株進行了革蘭氏染色，其中12 株為革蘭氏染色陽性無芽孢桿菌，長短不一，單個、成對、個別排列呈短鏈狀。

2.3 菌株的生理生化鑒定結果

2.3.1 乳酸桿菌屬的鑒定結果

通過運動性試驗，厭氧生長試驗，過氧化氫酶試驗，硝酸鹽還原試驗，吲哚試驗，明膠液化試驗等7 個鑒定指標，共5 個菌株符合乳酸桿菌屬的鑒別特征。可以初步確認為乳酸桿菌屬。具體結果見表1。

2.3.2 乳酸桿菌種間鑒定結果

乳酸桿菌種的鑒定主要是進行糖醇類發酵產酸試驗，在本研究中共應用了15 種糖醇。其中RS1 和RS2 兩株乳酸桿菌有14 種糖醇發酵產酸的鑒定結果符合嗜酸乳桿菌的鑒別特征，僅木糖不完全相符，可確定這2 株乳酸桿菌為嗜酸乳桿菌；菌株RS3 和RS4 僅山梨醇不完全符合植物乳桿菌鑒別特征，可確定其為植物乳桿菌；菌株RS5 僅松三糖和甘露醇不完全符合干酪乳桿菌假植物亞種鑒別特征，可確定其為干酪乳桿菌。具體結果見表2。

3 結論

在齊齊哈爾周邊地區部分豬場采集的健康仔豬糞樣中，共分離得到了乳酸桿菌5 株。其中嗜酸乳桿菌2 株，植物乳桿菌2 株，干酪乳桿菌1 株。

近年來，微生態制劑在世界范圍內得到了廣泛的開發和應用，并且促進了養豬業的迅速發展。國內外眾多學者針對豬腸道益生菌的種類，生物學特性，種屬特異性已有了較深入的研究，并開發出了諸多益生菌制劑產品，廣泛應用于臨床[7-8]。我國微生態制劑的研究和應用起步較晚，但相對起點高。許多領域內的大型企業已經按照國際標準建設了生產技術先進、產能高的微生態制劑生產線。

然而，實踐中發現仍有許多養殖戶對豬用微生態制劑的臨床應用效果懷有質疑。主要是因為飼喂后沒有達到預期效果。分析其原因：

一方面，可能與益生菌菌株特異性以及豬只生長發育階段有關系。應根據豬只不同生長發育階段腸道益生菌菌群特點，研發針對仔豬各個生長階段專用的益生菌制劑產品[9-10]。

另一方面，雖然許多微生態制劑領域內的企業已經按照國際標準建設了生產技術先進、產能高的微生態制劑生產線，但在益生菌種數量、制劑活菌數及保存期和生產總產量等方面同國外產品還存在一定的差距。

本研究鑒定得到的5 株乳酸桿菌，均分離自齊齊哈爾周邊地區健康仔豬腸道，具有地區特異性和物種特異性。通過安全性試驗，耐受力試驗及發酵條件等試驗，進一步研究這些乳酸桿菌在不同生理環境中的特性，可篩選適合于生產豬源微生態制劑的乳酸桿菌菌株。為研發適用于齊齊哈爾市周邊地區的豬用益生菌制劑提供科學依據。

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