干細胞移植治療缺血性心臟病:從基礎到臨床

王志國，高連如

心血管疾病是世界范圍內導致死亡的主要原因，全球每年約有1 700萬人死于心血管疾病，其中因急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)和慢性心功能不全而導致的死亡占心血管疾病病死率的50%以上。循證醫學研究表明，AMI即使早期成功血管重建也只能挽救缺血頓抑心肌。壞死心肌被纖維結締組織替代，向心室重構進展，有超過30%的患者發展為慢性缺血性心力衰竭。隨著人口的老齡化，心血管疾病患病率不斷增加，缺血性心力衰竭的患病率及病死率也在逐年升高[1]。如何解決心肌細胞丟失是心血管疾病治療中的關鍵問題。

20世紀末，美國科學家首次分離出人胚胎干細胞，并在體外成功建立了人胚胎干細胞系。與此同時，科學家發現，來自多種組織的成體干細胞可分化為其他胚層組織，即成體干細胞的可塑性。這項發現展現了生命科學的基礎研究與臨床應用的廣闊前景，細胞移植替代壞死心肌細胞的理念應運而生[2-3]。2001 年 Orlic[4]將骨髓干細胞移植到小鼠梗死心肌后9 d可見移植細胞在梗死心肌存活，并分化為具有心肌表型特征的心肌樣細胞，明顯改善了心臟功能。從此，干細胞移植治療缺血性心臟病迅速成為基礎和臨床研究的熱點。

1 主要用于治療缺血性心臟病的干細胞

1.1 骨骼肌源性干細胞 骨骼肌和心肌細胞同屬橫紋肌，骨骼肌源性干細胞來源廣，取材容易是其優點。已經有臨床研究表明，骨骼肌源性干細胞移植能夠改善心功能。2003年巴黎比夏醫院的Menasche等[5]對10例心肌梗死伴嚴重心力衰竭患者在行冠狀動脈搭橋術同時進行骨骼肌干細胞移植，隨訪10個月雖心功能改善，但4例發生室性心動過速，都需安置除顫起搏器。2004年Siminiak等[6]對心肌梗死伴心力衰竭患者同樣進行了骨骼肌干細胞移植術，術后依然有4例發生室性心動過速。上述研究結果表明，骨骼肌細胞和心肌細胞之間電偶聯可能存在問題。Hagège等[7]對全球2001年首批進行自身骨骼肌干細胞移植的患者進行長達52個月的隨訪，發現這些患者心功能分級指數有明顯改善，但也發現部分患者發生了室性心動過速而不得不植入自動體外除顫器(automated external defibrillator，AED)治療。也有臨床薈萃資料顯示，未發現致嚴重心律失常[8]。因此，骨骼肌干細胞移植的研究結果矛盾，安全性一直處于爭議之中，目前應用較少。

1.2 胚胎心肌細胞/胚胎源性干細胞 胚胎心肌細胞/胚胎源性干細胞目前僅有基礎研究，而無臨床研究報道。胎兒心肌細胞體內移植分化的研究表明[8]，急性心肌梗死大鼠模型制作成功后第5天將分離的胎兒心肌細胞分4點注射到心肌梗死區域。結果顯示，移植組大鼠梗死瘢痕組織中可見新生細胞生長，可觀察到移植的細胞間有閏盤連接。應用平滑肌a-肌動蛋白進行免疫組化染色證明，移植的胎兒心肌細胞已在壞死心肌區域存活、生長增殖。超聲心動圖可見細胞移植組大鼠左室收縮功能明顯改善，并限制了心室進一步擴大的重構過程。胎兒心肌細胞雖具有最好的再生心肌能力，但其臨床應用還存在許多問題，如倫理道德、法律以及免疫排斥、致腫瘤性等均有待解決[9]。

1.3 心肌源干細胞 心肌源干細胞目前已經有臨床應用報道。長期以來，人們一直認為心肌組織是一種終末化組織。2001年美國紐約醫學院Beltrami等[10]基礎研究表明，心肌內存在心肌干細胞。此后，Beltrami等[11]應用膠原酶消化成熟心肌細胞，以Lin－c-kit+和Sca-1+作為心肌干細胞表達的分子標志，應用免疫磁珠分離到心肌干細胞經體外誘導分化，7～10 d后29%～40%細胞轉化為心肌細胞，20%～26%細胞轉化為內皮細胞，18%～23%轉化為平滑肌細胞。將c-Kit+細胞注入冠狀動脈結扎后大鼠梗死心肌，20 d后，梗死面積明顯縮小，并可見冠狀小動脈及毛細血管再生。也有基礎研究報道Sca-1+心肌源干細胞移植未見到明顯效果[12]。在2011年Lancet發表心肌源干細胞臨床應用Ⅰ期臨床注冊研究報告，Bolli等[13]將自體心肌干細胞經冠狀動脈移植治療缺血性心肌病，入選患者全部有心肌梗死史，左心射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)＜40%，給予冠狀動脈灌注心肌干細胞后4個月14例LVEF提高8%，1年LVEF提高12.3%，磁共振檢查表明梗死范圍減少24%，無任何不良反應。目前正在進行Ⅱ期臨床試驗。自體心肌源干細胞關鍵問題在于需要外科手術且取材難，能提取的干細胞數量少，需要進一步增殖。

1.4 骨髓源性干細胞 骨髓源性干細胞是目前臨床應用最多的干細胞，來源于骨髓的各種干細胞群，包括造血干細胞、內皮祖細胞、單個核細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、側群細胞等。盡管其細胞成分復雜，干細胞含量低，但是多數研究者一致認為骨髓源作為供體細胞是包含多種原始細胞的混合細胞群體。其不僅提供了多種組分混合的具有多向分化潛能的原始細胞，也提供了多細胞間相互依賴生存的分化誘導微環境，將最大限度地發揮骨髓干細胞的分化潛能，更好地保留了原始干細胞的歸巢功能，更好的發揮了其旁/自分泌功能;且易于獲取，細胞數目較多，避免了在體外長期培養的污染機會等諸多優點;最重要的是可以從自體獲得，為自體干細胞，不存在倫理道德及免疫排斥問題。到目前為止，國外已發表20余個臨床研究，在New England Journal of Medicine報道了幾個較大的自體骨髓單個核細胞治療AMI的多中心、隨機對照甚至少數雙盲臨床研究[14-16]。Lipinski等[17]薈萃分析698 例 AMI，包括10個臨床研究，其中7個是隨機經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous transluminalcoronaryintervention，PCI)或PCI+骨髓單個核細胞經冠狀動脈移植，LVEF平均增加3(1.9～4.1)%，左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)平均減少7.4(2.7～12.2)ml，差異均有統計學意義;梗死面積平均縮小5.6(2.5～8.7)%。國內海軍總醫院心內科在2002—2010年進行了一系列自體骨髓單個核細胞經冠狀動脈移植治療缺血性心臟病的研究[18-21]，急性心肌梗死患者移植后3個月隨訪PET檢查顯示梗死區域內有代謝活力心肌增加，LVEF增加6.83%，而對照組單純PCI手術者無改善;2年隨訪表明，骨髓單個核細胞移植組左室射血分數1年保持增加5.79%(P＜0.05)，2年增加3.79%(P＞0.05)，但LVEDV、LVESV無顯著改善。有報道應用異體骨髓干細胞經靜脈輸注或安慰劑的隨機雙盲安慰劑對照臨床試驗結果表明，異體骨髓干細胞輸注安全，無不良反應，左室收縮功能及左室重構均優于安慰劑組[22]。異體骨髓干細胞移植主要存在來源困難、醫學倫理和免疫排斥等問題。

1.5 胚胎外組織來源的干細胞 如臍血MSCs、臍帶MSCs、胎盤MSCs等，其病毒污染概率低、免疫源性弱，無社會、倫理和法律方面的爭議。但臍血MSCs分離效率很低，臍帶、胎盤細胞混雜，限制了在細胞治療中的廣泛應用。目前，比較有前景的是臍帶華通膠(Wharton's jelly，WJ)源間充質干細胞。華通膠來源于胚胎發育13 d左右的胚外中胚層，包圍在遷移中的胚胎血島周圍，是一種黏稠的富含黏多糖和蛋白聚糖的膠狀物質，內含具有成纖維細胞和平滑肌細胞超微結構的成纖維細胞樣細胞，被稱為“肌纖維母細胞”。這些細胞在體外具備定向分化能力[23-24]，符合國際細胞治療學會對MSCs的規定，因此稱之為WJ-MSCs。WJ-MSCs增殖能力明顯強于骨髓MSCs，在體外培養倍增時間短，7次傳代后細胞數目可達300倍，傳15～20代細胞亦無明顯衰老。基礎研究表明，人WJ-MSCs移植給心肌梗死大鼠可改善左心室功能[25]，目前已經有臨床研究的安全性報道[26]。WJ-MSCs來源廣泛，取材方便，無倫理爭議，即使在剖腹產后48 h的臍帶中仍可獲得，具有較低的病毒污染率;而且凍存和復蘇后存活細胞數量無明顯減少，細胞結構和代謝無變化，可建庫使用，是組織損傷細胞學治療的理想選擇。

1.6 經基因工程修飾的干細胞 部分臨床試驗結果表明，干細胞移植后心功能沒有持續改善，考慮可能與干細胞的數量、生存情況和分化方向的不確定有關。選擇合適的目的基因，通過載體組合轉入干細胞中，有可能改善上述狀況，從而提高移植的效果。目前基礎研究有希望的基因:提高干細胞存活能力的抑制細胞凋亡的S100A1基因、AKT基因、bcl-2基因、Pim-1激酶基因等[27-30];促進干細胞歸巢的CC趨化因子受體1(CC chemokine receptor type 1，CCR1)基因[31];也有報道編程 connexin-43、connexin-45[32-33]基因可改善分化后的干細胞與宿主心肌細胞的電偶聯，減少移植后心律失常的發生。基因修飾干細胞應用于臨床主要是安全性問題，基因插入可能引起某基因失活、重組，甚至激活癌基因;而且目的基因的表達程度也難以控制，表達過高是否存在不良反應仍不清楚，目前尚未應用于臨床。

2 干細胞移植在心血管疾病治療中的主要方法

2.1 經冠狀動脈注射 經冠狀動脈注射是應用最為廣泛的移植方法[18-20]。其優點為細胞可以直接在介入治療過程中給予，無需特別的器械，經靶血管移植至目的心肌區域;經動脈移植也能保證移植的細胞有血液供應。根據冠狀動脈造影結果選用合理移植路徑，以移植細胞最大程度達到靶區域為目的，如選用超選擇性、左右主干灌注、側支血管逆行灌注、橋血管灌注等，使注入細胞彌散均勻，保證血流灌注，有利于移植細胞分化生長。其缺點為細胞需要經過血管壁遷移至血管外，效率低于直接心肌內注射移植。

2.2 經心外膜和經心內膜心肌注射 直接心肌注射效率要優于經冠狀動脈途徑注射，但注射部位如為缺血心肌組織甚至為瘢痕組織，移植的細胞常不能夠獲得足夠的血液供應;另外，局部注射移植很可能形成異常細胞島，致心律失常不容忽視[5]。經心外膜注射骨髓單個核細胞通常是冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting，CABG)的一個補充治療。經心內膜注射則需要特殊的器械(心內膜電機械標測系統)[34]，較為復雜。

2.3 經外周靜脈注射 經外周靜脈內注射法效率低于其他移植方法，有效性存在爭議。有研究表明，在梗死心肌內沒有發現移植歸巢的干細胞[35-36]。

2.4 經冠狀靜脈注射 經冠狀靜脈注射需要采用復雜的導管系統伴行技術(經靜脈心肌內注射)，盡管用球囊封堵，血流開放后血流方向會導致移植細胞流向心房，導致移植效率降低[37]。

3 干細胞移植治療缺血性心臟病的機制

干細胞移植治療缺血性心臟病的機制除了移植的干細胞分化為心肌組織細胞和新生血管外，移植細胞發揮的旁分泌作用目前越來越被重視。大量研究表明，移植的干細胞能夠產生大量生物活性因子，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor receptor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、促肝細胞生長素(hepatocyte growth-promoting factors，HGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGF)、腎上腺髓質素、胸腺素β4、基質細胞源性因子-1α(stromal cellderived factor-1alpha，SDF-1α)、血小板源性生長因子、心房利鈉肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)等，這些旁分泌因子的作用包括抗炎抗凋亡、減輕纖維化、促進新生血管生成、調節機體免疫、減輕心臟負荷的作用，從而最終修復受損組織并改善心臟功能[38-41]。

4 干細胞移植治療缺血性心臟病存在的問題

基礎和臨床研究均已表明，干細胞具有廣闊的應用前景。干細胞技術在帶給人們無限希望的同時也帶來了一系列的問題，其中首要的就是倫理問題。胚胎干細胞的利用將破壞生命的原始形態的胚胎，這方面倫理問題是公認的;更重要的是目前基礎研究進展快速，使得“一切均有可能”，“生物技術將打開通往后人類(post-human)的大門”[42]，這是即將要面對的更深層的倫理問題。國家需要作出具有法律效力的規定，并根據技術的進展不斷進行調整。而干細胞技術在臨床應用仍面臨遠期安全、質量控制、移植細胞在不同心肌微環境下的分化方向及如何控制等一系列問題，需要進行廣泛的臨床試驗。這些試驗潛伏著諸多不確定因素，因而有著很高的風險。

總之，目前干細胞移植治療心血管疾病的基礎研究已經積累了大量的數據及結果，臨床研究也取得了初步的成效，但是尚未能轉化為臨床的廣泛應用。目前，關鍵問題是基礎研究仍在進一步深入，但臨床應用則一直沒有實質性進展，遠遠落后于基礎研究。所以，下一步研究的重點是總結并完善目前已有的基礎研究成果，選擇最安全有效的技術真正轉化為臨床應用。

[1]曹芳英，朱智明.以心臟標志物為代表的心血管領域之轉化醫學[J].轉化醫學雜志，2012，1(1):49-53.

[2]Thomson JA，Itskovitz-Eldeor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science，1998，282(5391):1145-1147.

[3]Lindvall O，Hyun I.Medical innovation versus stem cell tourism[J].Science，2009，324(5935):1664-1665.

[4]Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium[J].Nature，2001，410(6829):701-705.

[5]Menasche R，Hagege AA，Vilquin JT，et al.Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction[J].J Am Coll Cardiol，2003，41(7):1078-1083.

[6]Siminiak T，Kalawski R，Fiszer D，et al.Autologous skeletal myoblast transplantation for the treatment of postinfarction myocardial injury:phaseⅠclinical study with 12 months of follow-up[J].Am Heart J，2004，148(3):531-537.

[7]Hagège AA，Marolleau JP，Vilquin JT，et al.Skeletal myoblast transplantation in ischemic heart failure:long-term follow-up of the first phase Ⅰ cohort of patients[J].Circulation，2006，114(1 Suppl):I108-I113.

[8]Dib N，McCarthy P，Campbell A，et al.Feasibility and safety of autologous myoblasty transplantation in patients with ischemic cardiomyopathy[J].Cell Transplant，2005，14(1):11-19.

[9]高連如，王志國，張寧坤，等.胎兒心肌細胞移植重建大鼠梗死心肌[J].中華醫學雜志，2003，83(20):1818-1822.

[10]Beltrami AP，Urbanek K，Kaistura JL，et al.Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction[J].N Engl J Med，2001，344(23):1750-1757.

[11]Beltrami AP，Barlucchi L，Torella D，et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration[J].Cell，2003，114(6):763-776.

[12]Li Z，Lee A，Huang M，et al.Imaging survival and function of transplanted cardiac resident stem cells[J].J Am Coll Cardiol，2009，53(14):1229-1240.

[13]Bolli R，Chugh AR，D'Amario D，et al.Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy(SCIPIO):initial results of a randomised phase Ⅰ trial[J].Lancet，2011，378(9806):1847-1857.

[14]Meyer GP，Wollert KC，Lotz J，et al.Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction:eighteen months'follow-up data from the randomized，controlled BOOST(bone marrow transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration)trial[J].Circulation，2006，113(10):1287-1294.

[15]Schachionger V，Erbs S，Elsasser A，et al.Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction[J].N Engl J Med，2006，355(12):1210-1221.

[16]Assmus B，Honold J，Schachionger V，et al.Transcoronary transplantation of progenitor cells after myocardial infarction[J].N Engl J Med，2006，355(12):1222-1232.

[17]Lipinski MJ，Biondi-Zoccai GG，Abbate A，et al.Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction:a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials[J].J Am Coll Cardiol，2007，50(18):1761-1767.

[18]高連如，朱智明，王志國，等.經冠狀動脈自體骨髓單個核細胞移植修復梗死心肌的臨床研究[J].中國介入心臟病學雜志，2004，12(5):265-269.

[19]高連如，王志國，田海濤，等.經冠狀動脈骨髓單個核細胞移植治療缺血性心臟病二年隨訪[J].中華醫學雜志，2007，87(10):685-689.

[20]Gao LR，Wang ZG，Zhu ZM，et al.Effect of intracoronary transplantation of autologous bone marrow-derived mononuclear cells on outcomes of patients with refractory chronic heart failure secondary to ischemic cardiomyopathy[J].Am J Cardiol，2006，98(5):597-602.

[21]Gao LR，Xu RY，Zhang NK，et al.Increased apelin following bone marrow mononuclear cell transplantation contributes to the improvement of cardiac function in patients with severe heart failure[J].Cell Transplant，2009，18(12):1311-1318.

[22]Hare JM，Traverse JH，Henry TD，et al.A randomized，double-blind，placebo-controlled，dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells(prochymal)after acute myocar-dial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2009，54(24):2277-2286.

[23]Karahuseyinoglu S，Cinar O，Kilic E，et al.Biology of stem cells in human umbilical cord stroma:in situ and in vitro surveys[J].Stem Cells，2007，25(2):319-331.

[24]陳宇，張寧坤，楊明，等.臍帶華通膠間充質干細胞的分離培養及鑒定[J].中國現代醫學雜志，2010，20(16):2412-2415，2420.

[25]Wu KH，Mo XM，Zhou B，et al.Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue[J].J Cell Biochem，2009，107(5):926-932.

[26]Chen H，Zhang N，Li T，et al.Human umbilical cord Wharton's jelly stem cells:immune property genes assay and effect of transplantation on the immune cells of heart failure patients[J].Cell Immunol，2012，276(1/2):83-90.

[27]Pleger ST，Most P，Boucher M，et al.Stable myocardialspecific AAV6-S100A1 gene therapy results in chronic functional heart failure rescue[J].Circulation，2007，115(19):2506-2515.

[28]Lim SY，Kim YS，Ahn Y，et al.The effects of mesenchymal stem cells transduced with Akt in a porcine myocardial infarction model[J].Cardiovasc Res，2006，70(3):530-542.

[29]Li W，Ma N，Ong LL，et al.Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function[J].Stem Cells，2007，25(8):2118-2127.

[30]Fischer KM，Cottage CT，Wu W，et al.Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase[J].Circulation，2009，120(21):2077-2087.

[31]Huang J，Zhang Z，Guo J，et al.Genetic modification of mesenchymal stem cells overexpressing CCR1 increases cell viability，migration，engraftment，and capillary density in the injured myocardium[J].Circ Res，2010，106(11):1753-1762.

[32]Roell W，Lewalter T，Sasse P，et al.Engraftment of connexin 43-expressing cells prevents post-infarct arrhythmia[J].Nature，2007，450(7171):819-824.

[33]Tong M，Yang XJ，Geng BY，et al.Overexpression of connexin 45 in rat mesenchymal stem cells improves the function as cardiac biological pacemakers[J].Chin Med J(Engl)，2010，123(12):1571-1576.

[34]Perin EC，Dohmann HF，Borojevic R，et al.Transendocardial，autologous bone marrow cell transplantation for severe，chronic ischemic heart failure[J].Circulation，2003，107(18):2294-2302.

[35]Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，et al.Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function[J].Nat Med，2001，7(4):430-436.

[36]Barbash IM，Chouraqui P，Baron J，et al.Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium:feasibility，cell migration，and body dist ribution[J].Circulation，2003，108(7):863-868.

[37]George JC，Goldberg J，Joseph M，et al.Transvenous intramyocardial cellular delivery increases retention in comparison to intracoronary delivery in a porcine model of acute myocardial infarction[J].J Interv Cardiol，2008，21(5):424-431.

[38]Kwon SM，Lee YK，Yokoyama A，et al.Differential activity of bone marrow hematopoietic stem cell subpopulations for EPC development and ischemic neovascularization[J].J Mol Cell Cardiol，2011，51(3):308-317.

[39]Zisa D，Shabbir A，Suzuki G，et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)as a key therapeutic trophic factor in bone marrow mesenchymal stem cell-mediated cardiac repair[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，390(3):834-838.

[40]Deuse T，Peter C，Fedak PW，et al.Hepatocyte growth factor or vascular endothelial growth factor gene transfer maximizes mesenchymal stem cell-based myocardial salvage after acute myocardial infarction[J].Circulation，2009，120(11 Suppl):S247-S254.

[41]Pasha Z，Wang Y，Sheikh R，et al.Preconditioning enhances cell survival and differentiation of stem cells during transplantation in infracted myocardium[J].Cardiovasc Res，2008，77(1):134-142.

[42]Lauritzen P.Stem cells，biotechnology，and human rights:implications for a post-human future[J].Hastings Cent Rep，2005，35(2):25-33.