鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子及其潛在臨床轉(zhuǎn)化前景

梁 芳，曾朝陽，李桂源

鼻咽癌是鼻咽部常見惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，80%的鼻咽癌發(fā)生在中國，因此被西方學(xué)者稱為“中國癌”。鼻咽癌由于其發(fā)病部位隱蔽，早期癥狀不明顯，容易被人忽視，常常延誤診斷;一經(jīng)發(fā)現(xiàn)往往已處于中晚期，耽誤最佳的治療時機，治療效果不佳。因此，尋找鼻咽癌早期診斷和預(yù)警的分子靶標并開發(fā)相應(yīng)的臨床診斷和預(yù)警試劑盒是鼻咽癌轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個重要研究方向。

鼻咽部由于與外界直接相通，長期受各種外來的化學(xué)物質(zhì)刺激，同時溫暖濕潤的環(huán)境適于各種微生物的生長，是病原微生物(包括細菌、病毒等)侵入機體的重要門戶。鼻咽癌病因?qū)W研究表明，外來因素(特別是致癌微生物的刺激)導(dǎo)致的慢性炎癥是鼻咽癌發(fā)病的重要誘因，因此機體免疫系統(tǒng)在鼻咽癌早期的調(diào)控過程中起到了重要作用。

本課題組在國家重大科學(xué)研究計劃及多項國家自然科學(xué)基金項目資助下，運用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)對不同分化階段、不同組織類型和不同臨床分期的鼻咽癌標本進行大規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)鼻咽上皮分泌的固有免疫分子——腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate，lung and nasal epithelial clone，PLUNC)蛋白家族[1]和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(lactotransferrin，LTF)[2]是鼻咽上皮抵抗微生物感染第一道防線的重要組成部分，它們通過特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展，同時也可作為鼻咽癌早期診斷與干預(yù)的重要分子靶點。

1 PLUNC蛋白家族

本課題組通過抑制性消減雜交聯(lián)合cDNA微陣列技術(shù)，克隆了鼻咽組織相對特異性表達基因SPLUNC1和LPLUNC1[3]。它們均屬于PLUNC 蛋白家族，是一種分泌性的蛋白質(zhì)，集中表達在鼻咽、口腔、鼻腔、呼吸道及消化道[1，4]。本課題組通過全基因組表達譜芯片及大樣本組織芯片證實在鼻咽部中度炎癥時鼻咽黏膜表面分泌物中PLUNC蛋白含量已經(jīng)顯著降低，在癌前病變中進一步下降，在鼻咽癌早期PLUNC蛋白已經(jīng)檢測不到，因此PLUNC是一個非常靈敏和特異的鼻咽癌早期預(yù)警信號之一，可作為監(jiān)測鼻咽癌發(fā)生的分子標記物[5-6]。針對該蛋白家族，本課題組已經(jīng)成功研發(fā)了鼻咽癌早期診斷試劑盒，并已經(jīng)獲得了國家發(fā)明專利授權(quán)[7]。該試劑盒只需獲取受檢者少量的鼻咽部分泌物就可以檢測，無創(chuàng)、無痛、檢測簡便、成本較低，用于在健康體檢中進行鼻咽癌高風(fēng)險人群篩查具有極為廣闊的應(yīng)用前景;如能推廣應(yīng)用，可以達到鼻咽癌的極早期預(yù)測和判斷，大大提高鼻咽癌的早期檢出率;而鼻咽癌如果能早期發(fā)現(xiàn)，治療效果較好，患者預(yù)后比較理想。此外，本課題組在大量鼻咽癌病例中對放療后PLUNC蛋白水平與放療后患者生存率的關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)PLUNC蛋白表達水平與鼻咽癌患者治療后預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測鼻咽癌患者放療后預(yù)后的可靠指標之一。

PLUNC蛋白家族均包含殺菌滲透增強蛋白/脂多糖結(jié)合蛋白(bactericidal permeability-increasing protein/lipopolysaccharide-binding protein，BPI/LBP)結(jié)構(gòu)域，其中 LPLUNC1含有2個 BPI結(jié)構(gòu)域，而SPLUNC1只含有1個BPI結(jié)構(gòu)域。本課題組已經(jīng)通過實驗證實了PLUNC蛋白家族具有廣譜的殺滅細菌和病毒的能力，參與了機體固有免疫應(yīng)答反應(yīng)過程，對鼻咽部和上呼吸道黏膜抵抗外來細菌和病毒的侵襲具有非常重要的作用。重組PLUNC蛋白能與細菌脂多糖結(jié)合，殺滅或抑制細菌的生長。對于鼻咽癌重要致瘤病毒——EB病毒，PLUNC蛋白能夠促進EB病毒感染的細胞凋亡，抑制EB病毒致瘤蛋白 LMP1的表達，促進EB病毒包膜糖蛋白gp350/220復(fù)合體表達，從而啟動補體途徑對EB病毒進行識別清除，或直接破壞EB病毒的完整性等途徑抑制EB病毒的致瘤作用[6]。

2 乳轉(zhuǎn)鐵蛋白

本課題組利用湖南鼻咽癌高發(fā)家系，通過連鎖分析，首次發(fā)現(xiàn)染色體3p21部分區(qū)域與湖南家族性鼻咽癌發(fā)病緊密連鎖[8]，單體型分析將湖南家族性鼻咽癌易感基因定位于該染色體區(qū)段中約13.6 cm范圍內(nèi)。隨后，通過基于家系的傳遞不平衡分析對上述連鎖分析結(jié)果進行了確證[9]。發(fā)現(xiàn)染色體3p21這一新的鼻咽癌易感基因區(qū)后，利用基因芯片技術(shù)對位于該區(qū)域的所有基因在較大樣本鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織中進行了較系統(tǒng)的表達譜分析，以篩選該染色體區(qū)域的鼻咽癌易感基因候選者，發(fā)現(xiàn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(lactotransferrin，LTF)基因表達下調(diào)最為顯著[10-11]。隨后，我們自制的含976個組織點(包含正常鼻咽上皮、鼻咽癌及癌旁組織)的組織芯片[12]對以上篩選出的候選易感基因進行大樣本免疫組化和原位雜交驗證，證實乳轉(zhuǎn)鐵蛋白為細胞分泌性蛋白，在鼻咽癌癌旁和鼻咽慢性炎癥組織中高表達，而在鼻咽癌組織中低表達或者不表達。

乳轉(zhuǎn)鐵蛋白又名乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，是一種非血紅素類的鐵結(jié)合糖蛋白，主要由黏膜上皮細胞和多形核淋巴細胞產(chǎn)生，并分泌到乳汁、唾液、淚液、膽汁、胃腸液、氣管和鼻咽腔分泌物、生殖道分泌物和血漿中，其中以乳汁中的含量最高。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理功能廣泛，包括維持鐵穩(wěn)態(tài)、預(yù)防病原微生物感染和抑制過度炎癥反應(yīng)等，是機體免疫防御系統(tǒng)中的重要天然免疫分子之一。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達下調(diào)與其血清中EB病毒殼抗原IgA(virus capsid antigen-IgA，VCA-IgA)抗體滴度呈負相關(guān)[13]，推測乳轉(zhuǎn)鐵蛋白表達缺失或下調(diào)增加了EB病毒感染的概率。進一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察及免疫共沉淀實驗證實LTF能與B細胞上的EB病毒受體CD21分子結(jié)合，阻斷B細胞上的EB病毒結(jié)合位點，從而阻止EB病毒吸附并進入B細胞。同時，利用B細胞與上皮細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)LTF確實可抑制EB病毒由B細胞向上皮細胞的傳遞[14]。此外，LTF還能夠降低Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)對EB病毒DNA的識別能力，抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路的激活，減輕EB病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)LTF可以抑制鼻咽癌細胞的生長，將細胞周期阻滯于G0～G1期，能負調(diào)控絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的c-jun氨基末端激酶2(c-jun N-teuninal kinase 2，JNK2)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，下調(diào) cyclin D1和phos-RB，上調(diào)p21、p27。這說明LTF通過調(diào)控細胞周期和MAPK信號傳導(dǎo)通路抑制鼻咽癌細胞增殖[10]。研究還發(fā)現(xiàn)LTF可以抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。過表達LTF的鼻咽癌細胞系的侵襲與轉(zhuǎn)移能力明顯下降，接種裸鼠之后成瘤能力亦明顯下降，并且肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少。其分子機制主要是因為LTF能夠抑制3'-磷酸肌醇依賴性激酶(3'-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)，進而抑制AKT的磷酸化水平，另外LTF可抑制AKT的膜轉(zhuǎn)位。PDK1/AKT通路對腫瘤增殖以及轉(zhuǎn)移均有非常重要的影響。大樣本的臨床驗證亦發(fā)現(xiàn)LTF與鼻咽癌轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，具有很好的預(yù)后判斷的價值[15]。綜上所述，LTF不僅是鼻咽癌重要的天然免疫分子，還可作為鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床進展預(yù)測的分子靶標。

3 鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子在臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用前景

目前對鼻咽癌早期的檢驗方法主要是EB病毒血清學(xué)標記物如VCA-IgA、EB病毒早期抗原(early antigen IgG，EA-IgG)的抗體檢測，雖然這些指標的單獨或聯(lián)合應(yīng)用為鼻咽癌的診斷提供了有用的信息，但它們均缺乏足夠的靈敏度與特異性，仍然只能作為一種相關(guān)指標起提示作用，不能用來作為鼻咽癌的確診指標。即使是病理性的診斷，也難以一次性取到病變組織，無法避免對微小病灶的多次有創(chuàng)性取樣。鼻咽癌非典型病灶型或黏膜下型的病例雖經(jīng)多次活檢，常因無病理切片陽性結(jié)果而延誤治療。對于放療后的病例，當(dāng)其鼻炎組織表現(xiàn)不典型時，在判斷其病變是復(fù)發(fā)還是放療反應(yīng)上，也左右為難;尤其是某些放療后出現(xiàn)顱腦癥狀的患者，各項檢查(包括病理檢查)都很難準確判斷到底是放射性腦病還是癌灶向顱內(nèi)發(fā)展，極大影響治療策略。綜上所述，建立一種能對鼻咽癌患者進行篩查、診斷的無創(chuàng)性檢測方法，對鼻咽癌的早期篩查、診斷、預(yù)防及治療等具有重要意義。

惡性腫瘤的防治在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子作用開始于鼻咽癌的早期階段，并影響疾病的發(fā)生、發(fā)展全過程，是一類潛在的臨床篩查標記、治療靶標和預(yù)后指標。

PLUNC蛋白家族是正常人體呼吸道黏膜表面天然存在的蛋白質(zhì)，對人體完全無害，可以研發(fā)相關(guān)噴鼻劑、外傷敷料等，發(fā)揮其抗微生物、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的功效。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在人乳汁中含量豐富，對嬰幼兒的免疫保護作用和營養(yǎng)價值已得到廣泛認可，也被廣泛應(yīng)用到乳制品和其他保健品中。本課題組研究發(fā)現(xiàn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白可直接抵抗EB病毒入侵宿主細胞，并通過抗炎作用抑制微生物感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，保護機體免受過度的炎癥反應(yīng)所帶來的損傷。提示可以將乳鐵蛋白作為預(yù)防性藥物或營養(yǎng)品應(yīng)用于EB病毒感染相關(guān)的疾病患者如鼻咽癌患者或其易感人群，為乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在鼻咽癌等EB病毒相關(guān)疾病預(yù)防和干預(yù)中的應(yīng)用提供新的證據(jù)。同時，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白能抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的功能使得這種人乳中的天然成分在腫瘤的治療中也顯現(xiàn)出重要的臨床價值，有望成為臨床治療的分子靶標。相信這些鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子將具有極大的臨床潛在轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。

[1]周后德，李小玲，李桂源.新的天然免疫保護分子——PLUNC家族蛋白[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2004，31(9):767-771.

[2]黃宏斌，鄧敏，鄭瑛，等.天然免疫分子乳鐵蛋白抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2013[in press，http://www.pibb.ac.cn/cn/ch/common/create_pdf.aspx?file_no=20120540＆flag=1].

[3]Zhang B，Nie X，Xiao B，et al.Identification of tissue-specific genes in nasopharyngeal epithelial tissue and differentially expressed genes in nasopharyngeal carcinoma by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray[J].Genes Chromosomes Cancer，2003，38(1):80-90.

[4]郭小芳，陳攀，李夏雨，等.新的天然免疫保護分子SPLUNC1的結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2012，39(10):945-951.

[5]Zhou HD，F(xiàn)an SQ，Zhao J，et a1.Tissue distribution of the secretory protein，SPLUNC1，in the human fetus[J].Histochem Cell Biol，2006，125(3):315-324.

[6]Zhou HD，Li XL，Li GY，et al.Effect of SPLUNC1 protein on the Pseudomonas aeruginosa and Epstein-Barr virus[J].Mol Cell Biochem，2008，309(1/2):191-197.

[7]李桂源，周后德，周鳴，等.鼻咽組織特異性基因編碼蛋白的檢測試劑盒、制備及其應(yīng)用:中國，10047032.3[P/OL].2005-06-08[2013-01-05].http://211.157.104.87:8080/sipo/zljs/hyjs-yx-new.jsp?recid=CN200410047032.3.

[8]Xiong W，Zeng ZY，Xia JH，et al.A susceptibility locus at chromosome 3p21 linked to familial nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Res，2004，64(6):1972-1974.

[9]Zeng Z，Zhou Y，Zhang W，et al.Family-based association analysis validates chromosome 3p21 as a putative nasopharyngeal carcinoma susceptibility locus[J].Genet Med，2006，8(3):156-160.

[10]Zhou Y，Zeng Z，Zhang W，et al.Lactotransferrin:a candidate tumor suppressor-Deficient expression in human nasopharyngeal carcinoma and inhibition of NPC cell proliferation by modulating the mitogen-activated protein kinase pathway[J].Int J Cancer，2008，123(9):2065-2072.

[11]Zhou Y，Zeng Z，Zhang W，et al.Identification of candidate molecular markers of nasophary-ngeal carcinoma by microarray analysis of subtracted cDNA libraries constructed by suppression subtractive hybridization[J].Eur J Cancer Prev，2008，17(6):561-571.

[12]李桂源，范松青，馬健，等.一種用于腫瘤早期診斷的組織芯片及制備器具:中國，10022818.X[P/OL].2004-12-22[2013-01-05].http://211.157.104.87:8080/sipo/zljs/hyjs-yx-new.jsp?recid=CN200410022818.X.

[13]Zhang W，Zeng Z，Zhou Y，et al.Identification of aberrant cell cycle regulation in Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma by cDNA microarray and gene set enrichment analysis[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2009，41(5):414-428.

[14]Zheng Y，Zhang W，Ye Q，et al.Inhibition of Epstein-Barr virus infection by lactoferrin[J].J Innate Immun，2012，4(4):387-398.

[15]Deng M，Zhang W，Tang H，et al.Lactotransferrin acts as a tumor suppressor in nasopharyngeal carcinoma by repressing AKT through multiple mechanisms[J].Oncogene，2012[Epub ahead of print].