GSK－3β、PTEN、PLK1在兒童急性髓系白血病中的表達及意義

王 妍，徐酉華，胡艷妮，孫艷輝，金 鑫，楊桂存

（重慶醫科大學附屬兒童醫院／兒童發育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學重慶市重點實驗室／重慶市兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地 400014）

急性白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，傳統的化療和干細胞移植使兒童急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的5年生存率達到80%，而急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患兒的5年生存率只接近60%［1］。新型分子靶向化療藥物具有更強的抗腫瘤活性，且對正常細胞不良反應小。因此，尋找兒童AML的有效分子作用靶點至關重要。

糖原合酶激酶－3β（GSK－3β）是一種多功能的胞漿絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，研究證實它是治療2型糖尿病［2］、阿爾茨海默?。?］的有效藥物靶點，并且與癌癥的發生、發展密切相關［4］，但其在白血病中起激活作用還是抑制作用尚不明確。PTEN是第1個呈雙專一性磷酸酶活性的抑癌基因，它作為GSK3β的上游基因，可調控GSK3β的表達［5］。在成人急性白血病中存在與張力蛋白同源的位于第10號染色體磷酸酶基因（PTEN）基因的表達缺失［6］，但兒童 ALL患者骨髓標本中PTEN蛋白的表達高于非惡性疾病兒童［7］。Polo樣激酶1（PLK1）是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，可促進有絲分裂的進程，其抑制劑BI2536已經進入AML的Ⅰ期臨床實驗階段［8］。有研究認為GSK－3β可能是PLK1的負調控因子，在維系PLK1的功能方面發揮作用［9］。本課題組研究GSK－3β、PTEN、PLK1在兒童AML的表達和臨床的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗組為2012年3～9月重慶醫科大學附屬兒童醫院血液科收治的33例初診AML患兒骨髓（M12例，M215例，M36例，M41例，M56例，M62例，M71例 ；中位年齡6歲2個月）。按形態學、免疫學、染色體、基因（MICM）分型標準診斷。根據患兒的臨床以及實驗室指標按危險度分型將實驗組分為高危組、中危組、低危組，每組11例。對照組為10例骨科手術切除骨中抽吸的正常骨髓。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 無菌操作取骨髓液2～3mL，肝素抗凝，聚蔗糖（FicoLL）液（相對密度1.077g／mL）分離骨髓單個核細胞（BMMNC），取約5×106個細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，混勻后－80℃保存。

表1 GSK－3β、PTEN、PLK1、β－actin的引物及目的片段大小

1.2.2 裂解骨髓單個核細胞 離心沉淀細胞，加1mL裂解液RL充分裂解細胞。分別收集水相中的總RNA及有機相中的總蛋白。

1.2.3 RT－PCR檢驗 按北京百泰克生物技術有限公司高純總RNA快速提取試劑盒說明書提取RNA。按大連寶生物技術有限公司逆轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time說明書進行反轉錄。GSK－3β、PTEN、PLK1、βactin的引物及目的片段大小見表1，PCR條件：95℃預變性5 min；然后95℃變性30s；GSK－3β、PLK1、β－actin均為55℃退火30s，PTEN 60℃ 退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR產物分析 取PCR產物8μL在25～30g／L瓊脂糖凝膠中電泳，100V電泳45min。用紫外投射儀觀察并用粘膠成像儀照相，照片經Metamorphose Imaging Sight軟件進行分析并讀取吸光度值，分別取GSK－3β、PTEN、PLK1與actin吸光度比值（GSK－3β／actin、PTEN／actin、PLK1／actin）進行半定量分析。

1.2.5 酶聯免疫吸附實驗（ELISA） 采用ELISA雙抗體夾心法對有機相中的 GSK－3β、P－GSK－3β水平進行定量分析。操作步驟嚴格按上海滬尚生物有限公司 GSK－3β及P－GSK－3β ELISA試劑盒使用說明書進行。選擇450nm波長，在酶標儀上測定A值，以標準品A值繪制標準曲線。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料用表示，兩組間的比較采用t檢驗；組間兩兩比較采用F檢驗；兩組間的相關性研究采用Pearson相關檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA 在兩組BMMNC的表達 實驗組GSK－3βmRNA和PLK1mRNA的平均表達量較對照組的平均表達量高（P＜0.05）；實驗組PTEN mRNA的平均表達量較對照組的平均表達量低（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 兩組GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結果（）

表2 兩組GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結果（）

組別 n GSK－3β 330.55±0.16 0.50±0.16 0.71±0.18對照組 100.41±0.09 0.63±0.25 0.57±0.18 P mRNA PTEN mRNA PLK1mRNA實驗組0.012 0.012 0.040

2.2 GSK－3β蛋白及P－GSK－3β蛋白在兩組BMMNC的表達情況 實驗組GSK－3β蛋白的平均濃度較對照組的平均濃度高（P＜0.05）；實驗組P－GSK－3β蛋白的平均濃度較對照組的平均濃度低（P＜0.01）。見表3。

圖1 兩組 GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結果

表3 兩組 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA檢測結果（pg／mL，）

表3 兩組 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA檢測結果（pg／mL，）

組別 n GSK－3β P－GSK－3β 33 2553.40±358.59 294.17±40.53對照組 10 2204.02±283.52 350.53±53.32 P實驗組0.014 0.002

2.3 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白及P－GSK－3β與臨床指標的相關性 實驗組GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白 及 P－GSK－3β的表達與性別、肝脾是否腫大均無明顯相關性，僅GSK－3β蛋白的表達與外周血白細胞計數增高呈正相關（P＝0.011）。臨床危險度高則 GSK－3βmRNA［高危組高于中危組（P＝0.012），高危組高于低危組（P＝0.000）］、GSK－3β蛋白［高危組高于中危組（P＝0.012），高危組高于低危組（P＝0.003）］、PLK1mRNA［高危組高于低危組（P＝0.009）］表達相應增高。臨床危險度高則P－GSK－3β表達減低［高危組低于中危組（P＝0.047），高危組低于中危組（P＝0.036）］。PTEN mRNA的表達與臨床危險度分型無明顯相關性。

2.4 GSK－3β與PTEN mRNA、PLK1mRNA表達的相關性本研究中 GSK－3βmRNA、P－GSK3β與 PTEN mRNA 的表達無明顯相關性（r＝－0.265，P＝0.136；r＝0.023，P＝0.899），GSK－3β蛋白與PTEN mRNA的表達呈負相關（r＝－0.415，P＝0.016）。GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白與PLK1mRNA 的表達呈正相關（r＝0.388，P＝0.026；r＝0.427，P＝0.013），P－GSK3β與PLK1mRNA的表達無明顯相關性（r＝－0.319，P＝0.070）。

3 討 論

分子靶向藥物在白血病治療中發揮越來越重要的作用。近來研究表明GSK－3β為癌基因，使用GSK－3β的抑制劑BIO后TF－1、U937、K562和HL60細胞大量凋亡，但不影響正常造血干細胞的活性［10］。另有研究表明GSK－3β為抑癌基因，在APL中，ATO激活GSK－3β誘導 Mcl－1降解進而誘導NB4細胞分化［11］。本課題組前期研究表明兒童ALL中GSK－3β起癌基因的作用［12］。本實驗結果顯示兒童AML中GSK－3β在基因及蛋白水平均高表達，且表達水平與臨床分型呈正相關，GSK－3β蛋白與外周血白細胞計數呈正相關；P－GSK－3β低表達，與臨床分型呈負相關。因此，GSK－3β在兒童AML中可能同樣起癌基因的作用。

本研究中兒童AML骨髓標本中PTEN mRNA的表達量明顯低于對照組，其在兒童AML中可能起抑癌作用，但其表達量與臨床指標無相關性。

PLK1目前被認為是腫瘤治療過程中有價值的作用靶點，在AML動物模型中，PLK1的特異性的抑制劑NMS－P937聯合阿糖胞苷口服后，可使其較好地長期存活［13］；在成人AML中PLK1高表達，與不良預后呈明顯正相關［14］。本研究中兒童AML骨髓標本中PLK1mRNA的表達量同樣明顯高于對照組，且其表達量與臨床分型呈一定正相關，表明PLK1在兒童AML中可能同樣起癌基因的作用。

腫瘤中抑癌基因PTEN主要通過兩種作用途徑調控GSK－3β的表達：一種為通過降低對PI3K／AKT信號通路的抑制，增強AKT對GSK－3β的抑制性磷酸化，GSK－3β的表達減少［5］；一種為通過增強對cdc42活性的抑制，降低cdc42信號通過對GSK－3β的抑制作用，GSK－3β的表達增加［15］。本研究初步顯示兒童AML中，GSK－3β蛋白與PTEN mRNA的表達呈現一定負相關。因此，兒童AML中，PTEN可能主要通過cdc42信號通路調控GSK－3β的轉錄后水平的表達。

在肺癌中，GSK－3β的抑制劑LiCl能增強PLK1的啟動子活性，促進PLK1的表達，提示GSK－3β可能是PLK1的負調控因子［9］。而本研究結果顯示 GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白與PLK1mRNA的表達呈正相關。本課題組前期研究表明兒童ALL中 GSK－3β高表達，且其正向調控 NF－κB信號通路［12］。Lin等［16］研究表明 NF－κB的亞基 RelA 通過直接與PLK1的啟動子結合，增強PLK1的轉錄。因此，在兒童AML中，GSK－3β可能通過正向調控 NF－κB信號通路從而增強PLK1的轉錄。

綜上所述，兒童AML中，GSK－3β和PLK1可能起癌基因的作用，而PTEN起抑癌基因的作用，三者在白血病中的作用機制有待進一步探討，可能成為兒童AML危險度分型的指標及靶向治療的有效作用靶點。

［1］Pui CH，Carroll WL，Meshinchi S，et al.Biology，risk stratification，and therapy of pediatric acute leukemia：an update［J］.J Clin Oncol，2011，29（5）：551－565.

［2］Gum RJ，Gaede LL，Koterski SL，et al.Reduction of protein tyrosine phosphatase 1Bincreases insulin－dependent signaling in ob／ob mice［J］.Diabetes，2003，52（1）：21－28.

［3］Gandy JC，Melendez－Ferro M，Bijur GN，et al.Glycogen synthase kinase－3β（GSK3β）expression in a mouse model of Alzheimer′s disease：a light and electron microscopy study［J］.Synapse，2013，67（6）：313－327.

［4］Miyashita K，Nakada M，Shakoori A，et al.An emerging strategy for cancer treatment targeting aberrant glycogen synthase kinase 3beta ［J］.Anticancer Agents Med Chem，2009，9（10）：1114－1122.

［5］Al－Khouri AM，Ma Y，Togo SH，et al.Cooperative phosphorylation of the tumor suppressor phosphatase and tensin homologue（PTEN）by casein kinases and glycogen synthase kinase 3beta ［J］.J Biol Chem，2005，280（42）：35195－35202.

［6］沈權，陳澤，劉旭萍，等.抑癌基因PTEN mRNA在白血病細胞中的表達及意義［J］.中華血液學雜志，2005，26（8）：493－496.

［7］Gauffin F，Diffner E，Gustafsson B，et al.Expression of PTEN and SHP1，investigated from tissue microarrays in pediatric acute lymphoblastic，leukemia［J］.Pediatr Hematol Oncol，2009，26（1）：48－56.

［8］W?sch R，Hasskarl J，Schnerch D，et al.BI＿2536－targeting the mitotic kinase Polo－like kinase 1（Plk1）［J］.RecentResultsCancer Res，2010，184：215－218.

［9］周瓊，白明，辛建保，等.氯化鋰抑制A549細胞增殖及其對Polo樣激酶1轉錄活性的影響［J］.中國生物化學與分子生物學報，2006，22（10）：832－838.

［10］Holmes T，O′Brien TA，Knight R，et al.Glycogen synthase kinase－3beta inhibition preserves hematopoietic stem cell activity and inhibits leukemic cell growth［J］.Stem Cells，2008，26（5）：1288－1297.

［11］Wang R，Xia L，Gabrilove J，et al.Downregulation of Mcl－1through GSK－3βactivation contributes to arsenic trioxide－induced apoptosis in acute myeloid leukemia cells.［J］.Leukemia，2013，27（2）：315－324.

［12］Hu Y，Gu X，Li R，et al.Glycogen synthase kinase－3βinhibition induces nuclear factor－κB－mediated apoptosis in pediatric acute lymphocyte leukemia cells［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29：154－159.

［13］Valsasina B，Beria I，Alli C，et al.NMS－P937，an orally available，specific small－molecule polo－like kinase 1inhibitor with antitumor activity in solid and hematologic malignancies［J］.Mol Cancer Ther，2012，11（4）：1006－1016.

［14］Renner AG，Dos Santos C，Recher C，et al.Polo－like kinase 1is overexpressed in acute myeloid leukemia and its inhibition preferentially targets the proliferation of leukemic cells［J］.Blood，2009，114（3）：659－662.

［15］Deevi R，Fatehullah A，Jagan I，et al.PTEN regulates colorectal epithelial apoptosis through Cdc42signalling［J］.Br J Cancer，2011，105（9）：1313－1321.

［16］Lin DC，Zhang Y，Pan QJ，et al.PLK1is transcriptionally activated by NF－κB during cell detachment and enhances anoikis resistance through inhibitingβ－catenin degradation in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2011，17（13）：4285－4295.