米諾環(huán)素對慢性腦低灌注大鼠空間學習記憶能力及海馬BACE-1和Aβ表達的影響

李國艷， 余昌胤， 楊 華

隨著我國步入老年化社會，慢性腦低灌注性認知功能障礙已成為中老年人生活質量下降的原因之一。慢性腦低灌注時有多種機制參與損傷認知功能，其病理生理過程較為復雜，主要涉及血腦屏障破環(huán)、腦白質脫髓鞘、細胞凋亡、炎癥反應、膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)受損、Aβ產(chǎn)生及聚集等多個環(huán)節(jié)［1，2］。本實驗擬通過結扎雙側頸內動脈建立大鼠慢性腦低灌注模型，采用米諾環(huán)素進行干預，觀察米諾環(huán)素對大鼠學習記憶能力及海馬區(qū)Aβ及BACE-1表達的影響，以探討米諾環(huán)素對慢性腦低灌注大鼠學習記憶功能的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 72只SD大鼠，雌性，體重200～250g，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，清潔級，常規(guī)分籠飼養(yǎng)。采用國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食。適應性喂養(yǎng)1w，然后按抓取隨機原則分組:假手術組(分為造模后1個月、2個月、3個月組)、慢性腦低灌注組(模型組，分為造模后1個月、2個月、3個月組)和米諾環(huán)素治療組(治療組，分為造模后1個月、2個月、3個月組)，每組8只。術中出血較多、出現(xiàn)呼吸困難及提前死亡者予剔除，并補足相應例數(shù)。

1.2 動物模型制作方法 制作慢性腦低灌注大鼠模型參照 Liu等［3］的方法:大鼠手術前禁食12h，禁水4h，用10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切口，然后分離出雙側頸總動脈，用雙重絲線行雙頸總動脈永久性結扎術后，縫合皮膚。假手術對照組除不結扎頸總動脈外，其他操作與模型組相同。用生理鹽水將米諾環(huán)素稀釋成0.5mg/ml濃度的溶液備用。米諾環(huán)素治療組在慢性腦低灌注模型的基礎上予50mg/kg/d的米諾環(huán)素溶液灌胃;假手術組和慢性腦低灌注組每天給予等量NS灌胃。米諾環(huán)素的劑量選擇參考 Stirling 等［4］和 Hewlett［5］的米諾環(huán)素神經(jīng)保護作用機制研究。

1.3 Morris水迷宮實驗 各組分別在造模后1個月、2個月和3個月采用Morris水迷宮對大鼠進行學習記憶能力的檢測(參照Vorhees等［6］總結的方法):水迷宮為一圓形水池，其直徑150cm，高60cm，池中水深32cm，水溫保持22℃。在池壁上等距離分別依次標記4個方向:東(E)、南(S)、西(W)、北(N)，在 ES象限(第四象限)正中離池壁30cm處放一個圓形平臺，平臺直徑為10cm，高30cm。水池上方安有攝像頭，圖像經(jīng)視頻輸入計算機，大鼠的運動軌跡被同步記錄。連續(xù)訓練4d，每天訓練兩次，每次隨機在NW、W、SW和E方向中選擇一個作為入水點，觀察并記錄大鼠爬上平臺的軌跡圖及所需時間(定位航行潛伏期)。如果大鼠在120s內找不到平臺，則將大鼠引至平臺并在平臺上停留20s。第5天去除平臺，選擇NW作為入水點，觀察并記錄大鼠的游泳速度以及120s內在ES(第四象限)的游泳時間(空間探索時間)，每只大鼠檢測一次。

1.4 組織取材 在Morris水迷宮訓練結束第2天，用10%水合氯醛0.3ml/100g于大鼠腹腔注射麻醉后，快速暴露心臟，先用生理鹽水經(jīng)升主動脈快速灌注沖洗3～5min，再用卵圓鉗夾閉大鼠的腹主動脈，經(jīng)左心室灌注4%多聚甲醛(PBS溶解，pH 7.4)約150ml，灌注固定后斷頭取腦，標本放入4%多聚甲醛液中浸置，24h內石蠟包埋。取海馬組織連續(xù)4μm厚切片。每個標本切2張切片，本實驗共144張切片。待切片干燥后72張行免疫組化染色測定海馬Aβ蛋白表達，另72張行免疫組化染色測定海馬BACE蛋白表達。

1.5 免疫組織化學染色法 切片脫蠟、水化，切片加入0.01mol檸檬酸鈉緩沖液中微波中高火10min進行抗原修復，待冷卻后，3%H2O2去離子水孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS洗3次，每次2min。不同的切片分別加入適量兔抗人BACE多克隆抗體(1∶25稀釋)或兔抗人Aβ多克隆抗體(1∶50稀釋)，4℃濕盒內過夜。第2天置于37℃溫箱復溫45min，PBS洗3次，每次2min。滴加二抗后置于37℃溫箱孵育45min，DAB溶液顯色5～10min，蘇木精對比染色;常規(guī)脫水，封片。

1.6 圖像分析 在10×40倍光鏡下觀察海馬CA1、CA3兩個分區(qū)，BACE、Aβ 陽性細胞胞漿呈棕黃色，部分細胞核亦著色。隨機選取5個非重疊的視野，進行免疫反應陽性細胞數(shù)計數(shù)，以個/視野為單位，結果取5個視野的平均值。所觀察的每個視野均由病理科3名高級職稱人員進行陽性細胞計數(shù)，如3人判斷同一視野陽性細胞數(shù)相同則納入研究對象。圖片采用Motic Image Devices 2.0圖文采集系統(tǒng)獲取。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料均采用均數(shù)±標準差()表示，數(shù)據(jù)處理組內比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析、組間比較采用單因素方差分析，P﹤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P﹤0.01表示統(tǒng)計學有顯著性差異。

2 結果

2.1 Morris水迷宮試驗

2.1.1 在連續(xù)4d的訓練中，各組大鼠每天全程訓練游到平臺的時間取平均值即為每天的水迷宮平均潛伏期。本試驗顯示，與同時點模型組比較，各假手術組和治療組第4天定位航行潛伏期均有不同程度縮短(P ＜0.05，P ＜0.01);隨著時間的推移，模型組潛伏期逐漸延長，但模型組1個月、2個月、3個月之間差異無顯著性。假手術組和治療組之間潛伏期比較差異無顯著性(見表1)。

2.1.2 空間探索實驗主要考察大鼠的記憶能力 第5天模型組大鼠第四象限的游泳時間(空間探索時間)明顯降低，并隨著時間的推移，空間探索時間逐漸縮短，模型組3個月與模型組1個月比較差異有顯著性(P＜0.05);與同時點模型組比較，各假手術組、治療組空間探索時間均有不同程度增加(P ＜0.05，P ＜0.01)。假手術組和治療組之間探索時間比較差異無顯著性(見表2)。

2.2 各組大鼠腦組織BACE和Aβ的表達

2.2.1 本實驗顯示 假手術組和治療組BACE的表達與同時點模型組比較明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。模型組 BACE 的表達隨時間逐漸增加，但組內比較差異無顯著性(P＞0.05)。假手術組和治療組比較BACE的表達差異無顯著性，治療組組內比較差異無顯著性。以上結果說明米諾環(huán)素能抑制BACE的表達(見表3)。

2.2.2 本實驗顯示 假手術組和治療組Aβ的表達與同時點模型組比較明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。模型組Aβ的表達隨時間逐漸增加，其中3個月組與1個月、2個月組比較差異有顯著性(P＜0.05)。假手術組和治療組比較Aβ的表達差異無顯著性，治療組組內比較差異無顯著性。以上結果說明米諾環(huán)素能抑制慢性腦低灌注所致的Aβ的表達(見表4)。

表1 3組大鼠Morris水迷宮試驗第4天潛伏期(s)比較(，n=8)

表1 3組大鼠Morris水迷宮試驗第4天潛伏期(s)比較(，n=8)

與同月模型組比較*P＜0.05，與同月模型組比較﹟P＜0.01

組別 假手術組 模型組 治療組1個月2個月3個月51.21 ±13.50*50.70 ±13.56﹟45.43 ±7.67﹟80.97 ±15.80 85.76 ±10.35 89.90 ±14.22 55.41 ±17.85*58.04 ±17.15*56.50 ±13.12﹟

表2 3組大鼠Morris水迷宮試驗空間探索時間(s)比較()

表2 3組大鼠Morris水迷宮試驗空間探索時間(s)比較()

與模型組比較*P＜0.05，﹟P＜0.01;模型組3個月與模型組1個月比較△P＜0.05

組別 假手術組 模型組 治療組1個月2個月3個月56.14 ±6.28﹟55.22 ±14.98﹟56.77 ±12.67﹟21.02 ±7.30 16.79 ±6.88 9.96 ±3.60△40.78 ±15.26*38.51 ±10.83*43.07 ±12.32﹟

表3 3組大鼠海馬BACE(個/視野)的表達()

表3 3組大鼠海馬BACE(個/視野)的表達()

與模型組比較*P ＜0.05，﹟ P ＜0.01

組別 假手術組 模型組 治療組1個月2個月3個月5.65 ±3.53﹟3.45 ±3.95﹟4.30 ±3.71﹟15.80 ±8.06 19.55 ±9.14 26.10 ±9.65 6.30 ±2.13﹟7.65 ±2.37*12.00 ±1.02﹟

表4 3組大鼠海馬Aβ(個/視野)的表達()

表4 3組大鼠海馬Aβ(個/視野)的表達()

與模型組比較*P＜0.05，﹟P＜0.01;模型組3個月與模型組2個月比較△P＜0.05

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3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進行性腦內神經(jīng)元變性疾病，病理上主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞內神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)和細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid proteion，Aβ)沉積所致的老年斑(senile plaques，SP)的聯(lián)合發(fā)生，神經(jīng)原纖維纏結主要由tau蛋白過度磷酸化引起。AD病理變化中固定的一點是在大腦和邊緣皮質部形成細胞外淀粉樣斑塊，以及在腦膜和大腦的血管壁上有淀粉樣化學類似物的沉積，其主要組成是4kD的β淀粉樣肽(Aβ)。42個氨基酸形成的Aβ-Aβ42的過量產(chǎn)生已證實是幾種家族性早發(fā)性AD 共同的起因［7］。

Aβ是由其前體蛋白β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor pretein，APP)水解產(chǎn)生的。APP有多種酶切方式，分別由不同的分泌酶參與水解過程。Aβ是β和γ分泌酶(β、γ-secretase)共同作用的結果，其中β分泌酶(β-site APP cleaving enzyme)是關鍵的限速酶，與AD的發(fā)生密切相關［8］，對β分泌酶的研究為開發(fā)治療AD的藥物提供了依據(jù)和線索。1999年，幾個獨立的實驗室先后報道了他們用不同的方法確定的β分泌酶，是一種具有活性的酸性蛋白水解酶，分別稱為BACE-1(beta site APP cleaving enzyme)、memapsin2和Asp2，序列對比顯示它們是同一分子，現(xiàn)在通常將其稱之為BACE或BACE-1。

慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion)是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見的病理狀態(tài)，各種臨床與基礎研究顯示無論是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)還是血管性癡呆(vascular dementia，VD)都存在程度不同的慢性腦低灌注［9］。隨著生活水平的提高，慢性腦低灌注的發(fā)病呈上升趨勢，慢性腦低灌注性認知功能障礙已成為中老年人生活質量下降的原因之一。

慢性腦低灌注能引起腦代謝障礙及腦功能衰退［10］，有多種機制參與損傷認知功能，其病理生理過程較為復雜，其中以血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞、炎癥反應和Aβ產(chǎn)生及聚集最為明顯。AD特征性病理改變老年斑(senil plaques，SP)的主要成分是Aβ，近年的研究顯示，Aβ不但存在于AD中，而且與腦缺血關系密切。基礎研究顯示缺血性腦血管病患者中APP和Aβ的水平較正常增加［11］。實驗證明腦缺血能夠使大鼠腦內 APP、β-APP RNA表達上調，使Aβ生產(chǎn)增加，使BACE活性和表達增加［12～14］。Torre等實驗證明一過性腦缺血大鼠模型能誘導神經(jīng)元BACE mRNA表達增加［15］，提示腦缺血是誘導BACE活性增強的原因之一。

米諾環(huán)素(minocycline，MC)是第二代半合成的四環(huán)素類抗生素，臨床上主要用來治療感染性疾病，近年來研究表明，它不僅有抗微生物作用，還有顯著的抗炎、抗凋亡和抗氧化等作用，具有較強的抗炎作用、高親脂性、長期用藥安全性較好等特點。基礎研究顯示四環(huán)素類藥物可通過多重機制發(fā)揮其腦保護作用，包括通過抗炎機制、抑制基質金屬蛋白激酶的活性、保護血腦屏障、保護神經(jīng)元、清除氧自由基及抗細胞凋亡途徑等。在四環(huán)素類藥物中具有腦保護作用者依次為米諾環(huán)素、強力霉素和四環(huán)素。

大鼠雙側頸總動脈永久性結扎術是目前較常采用的一種慢性腦低灌注模型，結扎雙側頸總動脈后使大鼠15個腦區(qū)的局部血流量降低25%～87%。Morris水迷宮是目前主要用于檢測大鼠海馬相關的空間學習記憶能力的方法。通過水迷宮試驗，我們的結果顯示，慢性腦低灌注能使大鼠空間學習記憶能力降低，并隨著時間的推移，該能力有進一步下降，特別在記憶能力方面下降更為明顯，說明在慢性低灌注情況下，缺血缺氧對學習記憶功能的影響是持續(xù)的、漸進的。通過對大鼠行為學觀察，本實驗發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素能改善慢性腦低灌注大鼠的空間學習記憶能力。模型組定位航行潛伏期和空間探索時間與假手術對照組和米諾環(huán)素治療組的檢測結果均差異顯著，米諾環(huán)素治療組與假手術對照組檢測結果無顯著差異。治療組的空間學習記憶能力較模型組明顯改善，從行為學上說明了米諾環(huán)素具有腦保護作用。

APP在體內的裂解存在兩種途徑:非淀粉源途徑和淀粉源途徑［16］。非淀粉源途徑(α-secretase pathway)是指在α-分泌酶作用下，在Aβ的第16位賴氨酸和17位亮氨酸之間發(fā)生裂解，因而產(chǎn)生分泌型α-APPs及C83;C83再在γ-分泌酶的作用下生產(chǎn)不完整的Aβ，稱作p3成分。α-APPs具有降低細胞內Ca2+濃度、維持突觸可塑性及保護神經(jīng)元的功能。淀粉源途徑(β-secretase pathway)是在β-分泌酶的作用下，于Aβ的氨基端裂解，生成β-APPs及C99;C99再在γ-分泌酶的作用下，于Aβ的羧基端裂解產(chǎn)生完整的Aβ分子。非淀粉源途徑是APP代謝加工的主要途徑，在病理狀態(tài)下，淀粉源途徑增多，Aβ的分泌量可高于正常的4～10倍，導致Aβ的異常聚集。γ-分泌酶催化位置的不同可產(chǎn)生由39-43個氨基酸組成的長度不同的Aβ，其中有病理意義的是 Aβ40、Aβ42，腦內 Aβ42水平遠遠低于 Aβ40，前者是形成老年斑的主要成分。過量的Aβ有很強的自聚性，在老化因素(如過氧化物、興奮性氨基酸、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等)的作用下聚合沉淀，在神經(jīng)元間形成老年斑，引發(fā)一系列神經(jīng)毒性［17］，最終導致AD的產(chǎn)生。

近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，卒中后AD的發(fā)生率明顯增加，顯示腦缺血參與了AD的發(fā)生和發(fā)展［18］。AD患者在出現(xiàn)腦代謝降低、神經(jīng)元變性和認知功能減退之前即存在腦低灌注，病理研究表明多數(shù)AD患者缺血性損傷和AD病理共存［19］，顯示血管因素所致的缺氧與AD發(fā)病過程密切相關，但具體的機制仍不清楚。有實驗顯示缺氧可能通過調節(jié)α分泌酶、β分泌酶(BACE)的活動(降低α分泌酶的表達、增加BACE的表達)，選擇性地使APP通過淀粉源途徑裂解增加，從而使Aβ生產(chǎn)增加，促進了AD的發(fā)生與發(fā)展。

在本實驗中，我們用免疫組化方法對各組大鼠海馬區(qū)BACE、Aβ進行測定，結果顯示模型組BACE和Aβ的表達明顯高于假手術組與治療組，表明缺血后海馬Aβ表達增多，其原因可能與以下幾點有關:缺血損傷激活APP基因，使APP表達增加;BACE生成增加，APP經(jīng)β淀粉源途徑代謝相應增多;另外缺氧導致BBB的破壞，使通過BBB清除Aβ的功能受損［20］。本實驗結果顯示，米諾環(huán)素能明顯降低慢性腦低灌注后大鼠BACE、Aβ的表達，表明米諾環(huán)素能抑制BACE表達，使APP通過淀粉源途徑裂解減少，使Aβ生成減少，從而發(fā)揮其腦保護作用。

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