多重PCR快速檢測(cè)豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型方法的建立

謝燕婷

（廈門銀祥集團(tuán) 肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361000）

豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型常呈混合感染，在臨床上以受感染母豬產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬為主要特征，同時(shí)能導(dǎo)致疫苗免疫失敗，誘發(fā)繼發(fā)感染［1］。目前，對(duì)于病毒性疫病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學(xué)方法［2］，但這些方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性差等不足，當(dāng)豬群感染多種病原時(shí)，難以應(yīng)用常規(guī)方法進(jìn)行早期快速檢測(cè)和鑒別診斷。而多重PCR 方法可以在一份樣品中同時(shí)檢測(cè)出多種病原，對(duì)多種疾病進(jìn)行同步診斷，具有快速、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜病室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、瓊脂糖購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，Dneasy Blood&tissue kit 購(gòu)于德國(guó)Qiagen，AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Axygen，Endo-free Plasmid Mini KitⅠ質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega，TOPO TA Cloning Kit 購(gòu)自廈門英韋創(chuàng)津生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank 上發(fā)表的序列，引物選擇PRV gB 基因、PCV2 ORF2 基因?yàn)槠鋽U(kuò)增靶序列，借助Primer Premier 5.0 及DNAstar 軟件篩選設(shè)計(jì)出符合多重PCR 要求的2 對(duì)引物［3-4］。引物由廈門英韋創(chuàng)津生物科技有限公司合成，合成引物于-20 ℃保存。引物序列如下：

SuHV-1：5’CGATGGGGTAGTAGTGCT3’，3’GA ACCTCTGCGTGAACGG5’；

PCV2：5’GAGTAGTTTACATAGGGGTCA3’，3’ATTGCGGAGGAACCTATGC5’。

1.4 病毒DNA的提取 根據(jù)Dneasy Blood&tissue kit 提取試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行病毒核酸的提取。

1.5 mPCR 方法的建立 mPCR 反應(yīng)在50μL 體系中進(jìn)行，包括10×PCR bufer（Mg2+Free）5μL，2.5 mM dNTP 4μL，MgCl225 mM 3μL、單個(gè)病毒的各自上下游引物10μM 各1μL，TaqTM DNA 聚合酶5 U/μL 0.25μL，用去離子水補(bǔ)足50μL，于PCR 儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，57.9 ℃45 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR 產(chǎn)物的克隆、鑒定結(jié)果 對(duì)PRV、PCV2的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定，PRV、PCV2 分別為373 bp與430 bp，與預(yù)期目的片段一致。將測(cè)序結(jié)果與Genbank 上收錄的序列進(jìn)行BLAST 比較，結(jié)果表明擴(kuò)增片段分別為各自病毒的特異性條帶。

2.2 mPCR 反應(yīng)最佳退火溫度的確定 將混合好的反應(yīng)體系在不同的退火溫度條件下進(jìn)行mPCR反應(yīng)（見(jiàn)圖1），退火溫度分別為60.0 ℃、59.3 ℃、57.9 ℃、56.2 ℃、54.9 ℃、54.0 ℃、53.5 ℃。從圖1 可以看出，mPCR的最佳退火溫度為57.9 ℃。

2.3 單重PCR 及多重PCR的特異性試驗(yàn) 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，由瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)確定，結(jié)果表明PRV為373 bp，PCV2為430 bp，見(jiàn)圖2-圖3。以雙蒸水、PRV、PCV2、PPV、PRRSV、CSFV 病毒為模板分別進(jìn)行mPCR 反應(yīng)，結(jié)果表明雙蒸水、PPV、PRRSV、CSFV 病毒均未擴(kuò)增出條帶，見(jiàn)圖4。

圖1 不同退火溫度的PCR 反應(yīng)

圖2 PRVPCR 敏感性試驗(yàn)

圖3 PCV2 PCR 敏感性試驗(yàn)

圖4 單重PCR、多重PCR 反應(yīng)及特異性試驗(yàn)

2.4 PCR 擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn) 將提取的PRV、PCV2 質(zhì)粒用島津的紫外風(fēng)光光度計(jì)UV-1800 中的DNA 定量功能測(cè)定核酸濃度，經(jīng)過(guò)十次重復(fù)試驗(yàn)得出PRV 質(zhì)粒核酸濃度為161.75 ng/μL，PCV2 質(zhì)粒核酸濃度146.94 ng/μL。用滅菌雙蒸水進(jìn)行l(wèi)0倍倍比稀釋，取10倍倍比稀釋的病毒質(zhì)粒做模板分別進(jìn)行單個(gè)病毒PCR 反應(yīng)和進(jìn)行病毒mPCR 反應(yīng)，檢測(cè)其敏感性。結(jié)果表明，在單個(gè)病毒的PCR 反應(yīng)中，單個(gè)病毒PCR 反應(yīng)檢測(cè)限量為1.47×10-8～1.62×10-6ng；在病毒mPCR 反應(yīng)中，病毒mPCR 反應(yīng)的檢測(cè)限量為1.47×10-6～1.62×10-4ng，見(jiàn)圖5。

圖5 多重PCR 敏感性試驗(yàn)

3 討論

在mPCR 反應(yīng)中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，決定mPCR 反應(yīng)成功與否［5］。本研究從Genbank 上分別下載了21 株P(guān)CV2 基因和2 株P(guān)RV 基因，通過(guò)DNAstar 進(jìn)行比對(duì)，引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)以上2 種病毒各自保守的區(qū)域，分別為PCV2 ORF2 基因及PRV gB 基因，在最保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物。多重PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系中各組分的濃度及反應(yīng)條件直接影響試驗(yàn)效果。因此，在多重PCR 擴(kuò)增前需對(duì)PCR擴(kuò)增的各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使每個(gè)病毒的引物長(zhǎng)度為18～21 bp，G+C 含量在40%～55%，Tm 值盡量一致，避免引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在敏感性試驗(yàn)中，通過(guò)將單個(gè)病毒PCR的敏感性與mPCR的敏感性進(jìn)行比較，結(jié)果表明，4 種病毒的mPCR 敏感性相對(duì)減少了2個(gè)稀釋倍數(shù)，但其核酸檢測(cè)可至1.47×l0-6～1.62×10-6ng，仍然具有很強(qiáng)的敏感性。而多重PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)雙蒸水、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）多重PCR的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，作為臨床上豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒2 型感染的病原學(xué)快速診斷方法具有可行性。

［1］曲光剛，沈志強(qiáng)，管宇，等.PRV、PCV-2、PPV 多重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（1）：23-25.

［2］李維華，任慧英，劉文，等.PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV 復(fù)合PeR的應(yīng)用研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：12-15.

［3］Fengxiong Yue，Shangjin Cui，Chaofan Zhang，et al.A multiplex PCR for rapid and simμLtaneous detection of porcine circovirus type 2，porcine parvovirus，porcine pseudorabies virus，and porcine reproductive andrespiratory syndrome virusin clinical specimens［J］.Virus Genes，2009，38：392-397.

［4］Hirohito Ogawa，Osamu Taira，Takuya Hirai，et al.Multiplex PCR and mμLtiplex RT-PCR for inclusive detection of majorswine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections［J］.Journal of Virological Methods，2009，160（1/2）：210-214.

［5］岳豐雄，崔尚金，冉多良，等.多重PCR 方法用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2 型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒診斷方法的建立［J］.養(yǎng)豬，2010（3）：41-44.