復合微生物固態發酵豆粕的工藝條件研究

陳炳鈿 周文藝 吳 焜 連建蕓 李泳寧*

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013；2.福建新閩科生物科技開發有限公司 福州 350008）

近年來，隨著飼料工業的不斷發展，對蛋白飼料的需求量越來越大，同時由于捕撈過度等原因，造成魚粉產量減少，使得可用作動物生產的蛋白質資源十分缺乏，供給的短缺使魚粉價格居高不下，價格不斷上漲。蛋白資源的缺乏，嚴重制約了我國飼料工業的發展，為了減少對魚粉的依賴程度，具有高消化率的優質蛋白成為首選的替代品，而發酵豆粕就是其中一種。發酵豆粕具有較高的蛋白溶解度和較小的分子量，部分已達到小肽和氨基酸水平，有助于動物的消化吸收；同時發酵豆粕具有一定的芳香氣味，適口性較好，且消除了豆粕中的抗營養因子，減少了對動物生長產生不同程度的抑制作用［1］。因此，優質的發酵豆粕已經開始部分取代魚粉，并在畜禽和水產養殖業中發揮越來越重要的作用［2-4］。

豆粕的粗蛋白質含量較高，可達40%以上，且含多種氨基酸對畜禽攝入營養很有好處。但豆粕分子量較大，動物難以消化吸收，而且豆粕中含有抗營養因子，對動物的健康和生產性能產生了不良的影響，采用酶解或微生物發酵技術進行處理可以破壞其抗營養因子，分解大分子蛋白為小分子多肽，可有效提高蛋白質在動物體內的消化率［5-6］。

目前微生物發酵技術常采用曲霉、芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌等其中的一種或幾種的混合發酵工藝［7-9］，雖然能去除其中的抗營養因子，但混合發酵工藝控制難度大，豆粕蛋白的水解程度較低；同時多數發酵豆粕常用三氯乙酸可溶性氮來表征多肽含量，而未對其多肽的分子量進行表征。本試驗研究了一種新的復合微生物固態發酵工藝，根據所選菌株的生長代謝特性采用了先好氧后厭氧的固態分階段發酵工藝，并進行了條件優化，最終得到含有活性益生菌、乳酸和小分子肽的生物活性飼料，產品發酵豆粕中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分達到小肽和氨基酸的水平，是一種優質的蛋白產品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、釀酒酵母本實驗室保藏。

1.1.2 原料與試劑 豆粕購于福海糧油公司，豆粕粉碎并過80 目篩；玉米和麩皮均購于市場；其他試劑均為分析純。

1.2 種子培養基配方

地衣芽孢桿菌液體培養基（g/L）：葡萄糖10、蛋白胨5、硫酸鎂1.5、磷酸二氫鉀1.5，水1 000 mL，pH7.0。

釀酒酵母液體培養基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨5、氯化鉀0.5、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、硫酸鋅0.1、硫酸鐵0.1，水1 000 mL，pH7.0。

嗜酸乳桿菌液體培養基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、磷酸二氫鉀2、醋酸鈉5、檸檬酸銨2、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.2、吐溫80 1.0，水1 000 mL，pH6.2。

1.3 固態發酵培養基配方 固態發酵培養基的基質成分及配比（%）：豆粕95、麩皮4、硫酸銨0.1、磷酸氫二鉀0.1、硫酸鎂0.1、氯化鈉0.2、葡萄糖0.5。

1.4 發酵工藝 試管斜面→三角瓶→5 L 發酵罐→接種至固態發酵基質→固態淺盤發酵→檢測。好氧發酵階段采用通過管道直接向恒溫潔凈室內通入無菌空氣，厭氧發酵階段則關閉通氣，恒溫發酵。

1.5 檢測項目 菌體量測定：液體菌數采用顯微鏡血球板計數法，發酵豆粕則采用平板法計數。蛋白含量：采用凱氏定氮法，參照GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法。乳酸含量測定采用山東省科學院生物研究所生物傳感分析儀（SBA-40E）進行測定。多肽含量測定采用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法，參照文獻［9］測定方法。多肽分子量測定采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定。

2 結果與討論

2.1 復合微生物菌劑配比對豆粕發酵的影響 將地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌液體發酵后的菌種按下述比例混勻后，按10%接種量添加到已滅菌固態發酵基質上，并補入一定量無菌水至含水量為50%，采用淺盤好氧發酵工藝進行發酵，發酵后產物取樣進行分析檢測，結果見表1。

表1 復合微生物菌劑配比對固態發酵的影響

由表1 可以看出，三種菌株不同配比下發酵豆粕中的粗蛋白含量沒有顯著差異。當配比中地衣芽孢桿菌的含量較高時（2：1：1）×109，發酵后產物中多肽含量和總菌數均最高，這主要是由于地衣芽孢桿菌具有較快的生長速率和較高的產酶能力，在接種至固態培養基質后，快速生長且產生大量胞外酶能有效降解豆粕，多肽含量最高達16.27%。而當酵母菌和嗜酸乳桿菌含量較高時，會影響地衣芽孢桿菌的生長代謝，對蛋白的分解效果不佳，但代謝產乳酸的能力較強，乳酸含量較高，分別達到2.50%和2.89%。因此，綜合考慮各種指標，當地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的配比在（2：1：1）×109時可獲得較好的協同生長代謝的作用，發酵產物的各項指標均達到較優的水平，本試驗選擇（2：1：1）×109作為后續試驗的配比組成進行研究。

2.2 復合微生物接種量對豆粕發酵的影響 將上述優化配比后的菌種復配后，按5%、10%、15%、20%的接種量接入固態發酵基質，采用淺盤好氧發酵工藝法進行發酵，發酵后產物取樣進行分析檢測，結果見圖1。

圖1 復合微生物接種量對豆粕發酵的影響

從圖1 可以看出，當接種量從0～10%時，隨著接種量的增大，發酵后產物中的多肽含量顯著增加，當接種量達到10%時，多肽含量達到15.78%，再增大接種量時，產物中的多肽含量增加并不明顯。而從粗蛋白含量來看，在不同接種量條件下進行發酵，隨著接種量的增大，發酵后產物中的粗蛋白含量也隨之增加，但差別并不顯著，在接種量為20%時的粗蛋白含量最高，達到52.86%。此外，在接種量高時由于菌數量較高大，胞外酶活較高，隨著小分子蛋白的進一步降解，產生了脫氨的現象，發酵后產品酸味較重，氣味刺鼻、脫氨嚴重。因此，綜合考慮發酵效果及成本，采用10%接種量進行后續試驗。

2.3 含水量對豆粕發酵的影響 將復合微生物菌劑按10%接種量接種至固態培養基質上，分別補入一定的無菌水，控制含水量為40%、45%、50%、55%和60%，采用淺盤好氧發酵工藝進行發酵，發酵后產物取樣進行分析檢測，結果見圖2。

圖2 含水量對豆粕發酵的影響

從圖2 可以看出，當含水量為40%時對豆粕降解的降解效果較差，發酵豆粕中多肽含量較低，僅有14.36%。增加含水量到45%時多肽含量的增加顯著，45%含水量下的多肽含量達到17.21%，再增大含水量多肽含量略有下降，但當含水量達到60%時，多肽含量則顯著下降，僅達到14.52%。不同含水量對固態發酵過程中總菌數也有顯著影響，當含水量為45%時，微生物總菌數僅1.26×109，隨著含水量的增加，微生物總菌數顯著增加，當含水量為50%時，微生物總菌數最高達到2.06×109，通過鏡檢觀察，產物中地衣芽孢桿菌菌體生長旺盛。再增加含水量，總菌數略有下降，主要是由于含水量較高時不利于固態發酵中好氧發酵過程的通氣，導致地衣芽孢桿菌的生長代謝受到影響，但其發酵產物中酵母菌和嗜酸乳桿菌數明顯增加，細胞的生長和代謝活性較強，pH 值顯著下降。從發酵產物的形態看45%水分發酵產品亮黃色、質地干散，易于干燥；而60%含水量時為金黃色、芳香味、質地良好，產物結塊嚴重，不易于干燥。因此，綜合考慮發酵產物的質量和干燥成本，選擇45%含水量進行后續的試驗。

2.4 好氧厭氧發酵階段對固態發酵的影響 在上述優化條件下，根據微生物菌種特性進一步分階段進行固態發酵，采用了好氧厭氧分階段發酵法，考察在不同菌種發酵特性下對固態發酵的影響，結果見表2。

表2 好氧厭氧發酵階段對固態發酵的影響

從表2 可以看出，培養過程中好氧和厭氧發酵階段的時間變化對粗蛋白含量并無顯著差異。但隨著好氧培養時間的增加，明顯有利于改善接種后菌體的生長，好氧培養24 h、48 h和72 h的發酵產物中總菌數均達到20 億以上，其中通過鏡檢觀察，多數為地衣芽孢桿菌，可見，在前期增加好氧時間，有利于地衣芽孢桿菌的生長。而在純厭氧條件下有利于嗜酸乳桿菌的生長，因此，其最終產物中的乳酸含量較高，達到2.87%，pH 值也降到4.61 左右。從多肽含量來看，好氧階段在48 h 以上時可獲得較好的降解效果，多肽含量均達到17%以上，其中48 h的多肽含量最高，達19.22%。而純好氧培養條件下有利于地衣芽孢桿菌的生長，但地衣芽孢桿菌過量生長，大量地分泌胞外酶，隨著固態發酵的進行，最終形成脫氨，導致總氮含量下降，發酵產物的氨味重，無酒香味，適口性變差。因此，在固態發酵中增加一定的厭氧發酵時間有利于酵母菌和嗜酸乳桿菌的生長，其代謝產生乙醇和乳酸等代謝產物使得發酵產物芳香味濃，酸味強，增加了產物的適口性。

綜合三種益生菌株在固態發酵過程所起的作用和作用階段的特點，采用好氧48 h、厭氧24 h的固態發酵工藝可獲得較好的發酵效果。2.5 發酵豆粕中多肽的分子量分布 將發酵豆粕中可溶性多肽進行液相色譜分析，采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定多肽的相對分子量。以蛋清白蛋白（43 000 Da）、牛血清白蛋白（67 000 Da）和匙孔貝血藍蛋白（350 000 Da）為標準蛋白作標準曲線進行分析，牛血清白蛋白和發酵豆粕中多肽的液相色譜圖見圖3-圖4。

圖3 牛血清白蛋白液相色譜圖

圖4 發酵豆粕中多肽液相色譜圖

以三種標準蛋白的分子量對數和出峰時間作標準曲線，可得方程y=-1.1701x+24.939（R2=0.997）。從發酵豆粕中多肽的液相色譜圖中可以看出，其出峰時間均大于20 min，且大部分蛋白出峰時間均在21 min 后。通過標準曲線的方程計算，20.022 min 出峰蛋白的分子量約為16 000 Da，約占多肽蛋白含量的11.06%。而其他大部分蛋白出峰時間均在21 min之后，其相對分子量約為2 300 Da，占88.94%，多數在22 min 后出峰，其相對蛋白分子量約為320 Da。可見發酵豆粕中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分達到小肽和氨基酸的水平，是一種優質的蛋白產品。

3 結論

試驗分別采用液體發酵制備地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的菌種，將3 種微生物菌株按一定的比例接種于豆粕進行固態發酵，優化的發酵工藝條件為，地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的配比在為（2：1：1）×109，接種量為10%，含水量為45%。采用好氧48 h、厭氧24 h的固態發酵工藝，發酵產物中總菌數可達2.18×109cfu/g，，乳酸含量達2.51%，多肽含量達到19.22%，其中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分達到小肽和氨基酸的水平。

由此可見，根據三種益生菌株在固態發酵過程所起的作用和作用階段的特點，采用好氧48 h、厭氧24 h的固態發酵工藝可獲得較好的發酵效果，明前期好氧階段有利于地衣芽孢桿菌的生長代謝，產生大量的酶類和其他生物活性物質，后期轉為厭氧后，釀酒酵母和嗜酸乳桿菌成主導作用菌群，進一步生長代謝和降解固態基質，并產生乙醇和乳酸等生物活性物質。發酵產物多肽含量高，且多數達到小肽和氨基酸水平，同時含有大量的活性微生物和乳酸等生物活性物質，是一種優質的微生物酵解活性肽產品。

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