蛹蟲草子實體多糖抗突變作用

郭麗新，馮 哲，魏博洋，齊 彥，王世龍，趙 敏

(1.東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150040;2.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江哈爾濱150040;3.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010)

蛹蟲草(Cordyceps militaris(L.ex Fr)Link)，又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草在分類學上同屬于真菌門(Eumycota)，子囊菌亞門(Ascomycotina)，核菌綱(Pyrenomycetes)，球殼目(Sphaeriales)，麥角菌科(claviticpitaceae)蟲草屬(Coedyceps)［1］，是一種具有藥用及滋補功效的珍貴藥材。其“性平、味甘、益肺腎、補精髓、止血化痰”［2］，多用來治療肺結核、老人畏寒、咳嗽、產婦及老人貧血虛弱、自汗盜汗、腰膝酸痛、神經衰弱、咳血、吐血等。現代研究表明，蛹蟲草具有抗腫瘤［3］、抗氧化、抗衰老、增強免疫［4-5］，調節血糖等作用。李志等采用灌胃給藥的方式對人工蛹蟲草子實體水提物和醇提物對小鼠骨髓細胞微核率、小鼠精子崎形率的影響研究，以及通過體外對中國地鼠肺細胞株(CHL)細胞染色體畸變實驗，結果顯示其人工蛹蟲草子實體提取物未發現具有致突變作用［6］。突變是生物機體的遺傳物質所發生的可遺傳的變異。現代研究表明，許多嚴重危害人類健康的疾病如腫瘤、某些退行性病變以及衰老的發生都與突變作用有關。應用抗突變藥物來降低人體自身正常細胞和染色體的突變率，對于人類生命的健康有著深遠意義。本項目研究蛹蟲草子實體多糖對環磷酰胺誘導小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成及染色體畸變率的影響，探討蛹蟲草多糖抗突變活性，為抗腫瘤等作用研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級昆明種小白鼠，體重(20 ±2)g，雌雄各半 黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供;蛹蟲草 東北林業大學微生物教研室提供;CMPS 注射液 黑龍江中醫藥大學生化教研室制備;環磷酰胺 Sigma公司;秋水仙素 上海國藥集團化學試劑有限公司;氯化鉀、冰醋酸等均為分析純。

CHK-213 型生物顯微鏡日本奧林巴斯;AB204-N 電子分析天平;S.HH.W21-600 三用電熱恒溫水浴箱 上海躍進醫療器械廠;LDZ4-0.8 離心機 北京醫用離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗 將實驗小鼠隨機分為5 組，每組10 只:空白對照組、CTX 組和CMPS1、CMPS2、CMPS3 三個劑量組。空白對照組和CTX 組第1 ～10d 分別肌肉注射生理鹽水，CMPS1、CMPS2、CMPS3 組按25、50、100mg/kg 的劑量注射。CTX 組和CMPS 三組于第9、10d 腹腔注射環磷酰胺(環磷酰胺40mg/kg)，于第10d 注射CTX 6h 后，頸椎脫臼法處死小鼠，分離雙側股骨，剔凈肌肉，剪去股骨頭，用5mL 注射器抽取3mL 生理鹽水沖洗骨髓細胞，1000r/min 離心5min，棄去上清液，重懸細胞。常規制片，每只小鼠骨髓細胞涂3 張片子，編號，晾干，甲醇固定，1∶9 Giemsa 染色，油鏡觀察。選擇細胞完整、分散均勻、著色適當的區域，采用雙盲法計數，每只小鼠計數1000 個嗜多染紅細胞，并計數微核細胞(MN)數，計算微核千分率(MN‰)并按公式計算抑制率:

抑制率(%)=(陽性組MN 數-實驗組MN 數)/陽性組MN 數×100，數據以平均值±標準差表示，組間均數比較用t 檢驗。

1.2.2 小鼠骨髓細胞染色體畸變實驗 實驗動物品種、分組和前期處理方法同微核實驗，最后，注射CTX 2h 后，腹腔注射秋水仙素(4μg/g)，4h 后采用頸椎脫臼法處死小鼠，取雙側股骨，剔凈肌肉，剪斷股骨頭，用注射器吸生理鹽水沖洗骨髓細胞入離心管內，用吸管吹打均勻，1000r/min 離心8min，棄上清液后向離心管內加入9mL 0.075mol KCL 溶液，用吸管吹打均勻呈細胞懸液，置37℃水浴箱內低滲處理30min，固定，常規制片，玻片晾干，1 ∶9 Giemsa 染色8min，油鏡觀察。每只動物計數100 個分散良好、著色清晰的中期分裂相細胞，記錄染色體結構異常和數目異常的細胞。各組數據以平均值± 標準差表示，組間均數比較用t 檢驗。

2 結果與討論

2.1 CMPS 對CTX 誘發小鼠骨髓PCE 微核的影響

2.1.1 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的細胞學特征油鏡下觀察嗜多染紅細胞呈灰藍色，微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈藍紫色，直徑通常為紅細胞的1/20～1/5(圖1a)。經環磷酰胺處理后的小鼠骨髓細胞嗜多染紅細胞出現的微核細胞數增多，在1 個視野中，可連續2 個細胞同時出現微核(圖1b)。

圖1 小鼠骨髓微核圖(Giemsa 染色，×100)Fig.1 Micronuclei in mice bone marrow PCE

2.1.2 蛹蟲草多糖對CTX 誘發的小鼠骨髓PCE 微核率的影響 圖2 顯示，蛹蟲草多糖各劑量組可降低CTX 誘導的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率，CMPS三個劑量組小鼠微核抑制率分別為29.75%、36.20%、44.48%，抑制率隨劑量增多呈增加趨勢，各劑量組與環磷酰胺組比較，均有顯著性差異(p ＜0.05)。

圖2 小鼠骨髓PCE 微核率及抑制率Fig.2 Micronucleus rate and inhibition rates of PCE of bone marrow cells in mice

微核的形成是細胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學終點，凡能使染色體發生斷裂，并延遲到細胞分裂后期，或使染色體和紡錘體聯結遭到破壞的遺傳損傷，都可用微核實驗來檢測［7］，觀察細胞微核數的多少能判斷染色體復制與有絲分裂這兩個過程是否出現異常。因此，微核常作為化學物質是否有致突變性的一項觀察指標，在對外來化合物(如藥品、食品添加劑、農藥、化妝品、環境污染等)遺傳毒性和職業暴露人群遺傳損害檢測以及生態環境檢測方面［8］，都有大量的應用。哺乳動物紅細胞在成熟過程中能把主核排出胞外，微核滯留在胞內，易于識別，結果穩定、重復性好。

2.2 蛹蟲草多糖對CTX 誘導小鼠骨髓細胞染色體畸變的影響

由圖3 可知，經環磷酰胺處理后，小鼠骨髓細胞的染色體畸變的細胞學特征，主要表現為染色體的斷裂、環化和部分缺失。環磷酰胺為氮芥類衍生物，進入機體內可代謝為醛磷酰胺、磷酰胺氮芥等，與DNA 發生交叉聯結，損傷DNA、染色體結構與功能，使染色體和紡錘體聯結損傷，小鼠骨髓PCE 染色體發生斷裂等，具有遺傳毒性作用。

圖3 小鼠骨髓細胞染色體Fig.3 Chromosomes of bone marrow cells in mice

由圖4 可知，CMPS 三個劑量組染色體畸變率分別為36.7% ± 5.46%、20.8% ± 3.52%、18.1% ±3.28%，畸變率隨CMPS 劑量增多呈下降趨勢，高劑量組畸變率較低，CMPS 三組與CTX 組比較，均有顯著性差異(p ＜0.05)。

圖4 各組小鼠骨髓細胞染色體畸變率Fig.4 chromosome aberration rates of bone marrow cells in mice

骨髓細胞染色體畸變分析實驗觀察的是分裂間期與前期的細胞染色體畸變，可反映諸如斷片、裂隙、環狀染色體、多倍體等多種畸變結果，且結果可靠，能夠直接反應骨髓細胞染色體畸變發生率的高低，可判斷受試物是否具有突變作用［9］。

微核實驗、染色體畸變實驗是目前廣泛應用的經典檢測染色體損傷的技術，包括了細胞水平和染色體水平的檢測范圍。微核和染色體畸變存在著直接相關關系，但又不等同，微核反應部分染色體結構畸變，這里主要指不穩定性畸變;除染色體畸變的斷片可形成微核外，染色單體斷裂、單條或多條滯后的染色體也可形成微核，而染色體畸變實驗能在形態上更確切地觀察到染色體受損情況，在遺傳毒物篩選中這兩種檢測方法經常被采用。

環磷酰胺作為一種誘變劑可以誘導微核和染色體畸變的形成，在使用誘變劑的同時，給予蛹蟲草多糖，觀察其抗突變的作用。本項目微核實驗研究結果顯示空白對照組的微核率為1.90‰，處于自發突變的1‰～3‰的范圍內。蛹蟲草多糖三個劑量組對環磷酰胺誘發的小鼠骨髓PCE 微核形成均具有明顯的抑制作用，與環磷酰胺組比較，具有顯著性差異(p ＜0.05);小鼠骨髓細胞染色體畸變分析實驗結果顯示蛹蟲草多糖三個劑量組對環磷酰胺誘發的小鼠骨髓細胞染色體畸變率有降低作用，與環磷酰胺組比較具有顯著性差異(p ＜0.05)。微核實驗、染色體畸變實驗結果表明蛹蟲草多糖可降低環磷酰胺對染色體的損傷，具有抗突變活性，提示蛹蟲草多糖對接受致突變物質者具有很好的防護作用，結合蛹蟲草多糖增強免疫等保健作用，提示蛹蟲草、蛹蟲草多糖具有良好的應用前景。

3 結論

蛹蟲草多糖對環磷酰胺誘導的體內微核形成及染色體的損傷具有減輕作用，具有一定的抗突變活性。蛹蟲草多糖在抗腫瘤，阻止遺傳物質損傷等方面具有很好的作用。

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［4］Lin R，Liu H，Wu S，et al.Production and in vitro antioxidant activity of exopolysaccharide by a mutant，Cordyceps militaris SU5-08［J］.Int J Biol Macromol，2012，51(1-2) :153-7.

［5］張安寧，袁書林.不同劑量蛹蟲草菌絲體對大鼠免疫功能的影響［J］.食品研究與開發，2009，30(3) :30-34.

［6］李志，黃俊明，楊穎，等.人工蛹蟲草子實體不同提取物的致突變作用［J］.環境與職業醫學，2010，27(11) :698-700.

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