植物乳桿菌肌球交叉反應抗原MCRA的克隆表達及功能鑒定

楊 波，陳海琴，張白曦，宋元達，陳永泉，陳 衛，張 灝

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

共軛亞油酸(CLA，18∶2)是一類具有共軛雙鍵的亞油酸(LA，18∶2)的幾何和位置異構體的總稱。它具有很多營養和保健功能，如抗癌、抗動脈粥樣硬化和延緩機體免疫力衰退、減肥等［1－3］。瘤胃菌和丙酸菌中催化LA轉化為活性CLA的酶為亞油酸異構酶［4－6］，與瘤胃菌中較為清晰的催化機制相比，乳酸菌產CLA的機理至今尚無廣泛報道。最新的研究表明，植物乳桿菌AKU1009a中LA被MCRA催化為10－HOE后被另外兩個酶進一步催化而轉變為CLA［7］。該催化涉及多個酶，其中第一步反應是亞油酸被轉化為10－羥基－順12－十八碳烯酸，后經雙鍵異構和脫水兩步反應而轉變為CLA。第一步酶，即水合酶，與先前被預測具有多不飽和脂肪酸水合酶功能的肌球蛋白交叉反應抗原(Myosin cross reactive antigen，MCRA)具有良好的同源性，因此對該類抗原的酶學功能的研究顯得非常重要。肌球蛋白交叉反應抗原最早發現于化膿鏈球菌，并被預測具有轉化產生CLA的能力［8］，這類抗原在乳酸菌中普遍存在。Rosson等［9］嘗試過驗證羅伊氏乳桿菌 PYR8中的MCRA亞油酸異構酶的活性，但結果顯示該蛋白并不能實現LA至CLA的轉化，產物中檢測到了痕量的羥基化衍生物，本實驗室從泡菜中篩選到一株產CLA能力的乳酸菌－植物乳桿菌ZS2058，經研究得知該菌株在MRS培養基中經0.5mg/mL的亞油酸誘導培養后，所獲得的菌體細胞具有較強的CLA生成能力［10］。本研究依據已報道的瘤胃菌中亞油酸異構酶及乳酸菌中亞油酸水合酶－肌球蛋白交叉反應抗原MCRA的基因序列特征，通過生物信息學分析設計引物從植物乳桿菌ZS2058的基因組中克隆獲得該基因序列，構建大腸桿菌表達載體 pET28a－MCRA，將其轉化入大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌，經誘導表達及表達條件優化后對MCRA基因的活性進行研究。這是首次在大腸桿菌中實現植物乳桿菌ZS2058中肌球蛋白交叉反應抗原的活性表達，這將為實現完整闡述植物乳桿菌產CLA的機理提供理論依據。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ZS2058(Lactobacillus plantarum ZS2058)、大腸桿菌 Escherichia coli TOP10、E.coli BL21 由本實驗室保存;質粒pET28a Novagen公司;LB(Luria－Bertani)培養基 1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，使用時添加卡那霉素至終濃度50μg/mL;MRS培養基 2%葡萄糖，1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.5%酵母膏，0.2%檸檬酸氫二銨，0.5%乙酸鈉，0.2%磷酸氫二鉀，0.058%硫酸鎂，0.025%硫酸錳，0.1%吐溫 80，pH6.2～6.6，用于培養目的基因來源菌－植物乳桿菌ZS2058;限制性內切酶、T4 DNA連接酶 Takara公司;高保真DNA聚合酶KOD plusToyobo公司;基因組提取試劑盒 (北京)天根生物科技公司;底物 LA、內標十九烷酸Sigma－Aldrich公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Fermentas;其他試劑 進口或國產分析純;實驗中的引物的合成和測序工作由上海博尚生物有限公司完成。

PCR儀 Bio－RadT100、電泳儀 Bio－Rad PowerPac Basic型 美國 Bio－Rad公司;鎳柱Chelating sepharoseTMFast Flow 美國GE公司;氣質聯用色譜工作站Finnigan Trance GC/Finnigan Trance MS 美國Thermo公司。

本實驗所用的引物見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCRA基因的擴增 依據NCBI已報道的乳酸菌中亞油酸水合酶－肌球蛋白交叉反應抗原MCRA的基因序列特征，通過生物信息學分析設計表 1 引物(GenBank:JF747255.1，ZS2058MCRA－F、ZS2058MCRA－R)，分別引入 Xhol I、Not I酶切位點(下劃線)，以植物乳桿菌ZS2058的基因組為模板用高保真KOD plus進行PCR擴增，PCR反應條件:95℃ 5min;95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 2min，30 個循環;72℃ 10min。

1.2.2 重組質粒及重組菌的構建 將MCRA片段的PCR產物通過Xhol I和Not I雙酶切克隆至大腸桿菌質粒pET28a，得到表達載體pET28a－MCRA，將其化學轉化至E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌pET28a－MCRA/E.coli BL21(DE3)，同時構建 pET28a/E.coli BL21(DE3)作為陰性對照，并將重組菌中的表達質粒進行PCR驗證和測序驗證。

1.2.3 重組蛋白表達的SDS－PAGE和Western Blot檢驗 挑取單菌落接種于LB培養基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃震蕩培養至 OD600為0.6，加入 IPTG至終濃度0.8mmol/L，20℃、200r/min誘導培養20h。離心收集菌體并重懸于PBS緩沖液中(0.1mol/L，pH8.0)，在冰浴中進行超聲破碎，離心得上清和沉淀，進而將全細胞、上清和沉淀進行SDS－PAGE和Western Blot分析，具體方法見參考文獻［11］，分離膠濃度為12%。

1.2.4 重組酶表達誘導條件的優化 對誘導劑IPTG的濃度調整為0.01mmol/L和0.1mmol/L，誘導溫度分別為16℃和20℃，誘導20h。將誘導劑改換為0.2%乳糖，誘導條件仍為20℃，20h。

1.2.5 鎳柱初步純化重組酶 離心收集誘導結束的菌體，重懸于20mL磷酸鹽緩沖液中，加入20mg溶菌酶，4℃孵育10min，超聲波破碎。后細胞破碎液離心，上清用鎳柱純化，按照GE公司的產品說明進行操作。用咪唑濃度為50mmol/L和100mmol/L的緩沖液沖洗樣品柱，洗去雜蛋白。然后用咪唑濃度為200和300mmol/L的緩沖液洗脫目的蛋白，收集樣品進行SDS－PAGE分析和Western Blot分析。

1.2.6 重組蛋白活性的GC－MS檢測 在Volkov等［12］和 Rosberg－Cody 等［13］檢驗該類蛋白活性的基礎上進行改進，具體反應如下:將50μg LA或油酸(OA)和10μg純化的酶，于1mL Buffer A(0.1mol/L Tris/HCl，pH6.5，0.1mol/L NaCl)中 25℃反應 1h。根據Bligh和Dyer的方法［14］提取脂肪酸，以十九烷酸做內標，提取的脂肪酸溶于甲醇后以重氮甲烷進行甲酯化，甲酯化脂肪酸最終用1mL正己烷回溶，用于GC－MS檢測分析。GC－MS條件:Finnigan Trance GC/Finnigan Trance MS(美國 Thermo)，色譜柱:Agilent DB－WAX(30m ×0.250mm id×0.25μm，美國安捷倫)。GC升溫程序:180℃保持 0.5min，后以5℃/min的升溫速率升至230℃，保持13min。載體流量He:8mL/min，載氣流量He:8mL/min，氣化室溫度:250℃，進樣量:10μL，分流比:62∶1。質譜檢測條件:離子化方式:EI，電離電壓:70eV;發射電流200μA;柱上溫度250℃;離子室溫度230℃;檢測器電壓350V。

2 結果與分析

2.1 MCRA基因的擴增

以L.plantarum ZS2058基因組為模板，PCR擴增MCRA基因，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到1700bp大小的片段(圖1)，與預期的理論值大小相同。

2.2 表達載體pET28a－MCRA的構建

用Not I和Xhol I酶切質粒PCR產物MCRA和pET28a，膠回收目的片段，16℃過夜連接，連接產物轉化E.coli TOP10感受態細胞。過夜培養，挑取轉化子，擴大培養后抽提質粒，PCR驗證和酶切鑒定結果如圖2所示，得到預期大小的條帶。后經測序顯示成功構建了重組表達載體pET28a－MCRA。

圖1 PCR擴增MCRA基因Fig.1 PCR amplification of MCRA gene

圖2 鑒定重組質粒pET28a－MCRAFig.2 Identification of recombined plasmid pET28a－MCRA

2.3 重組表達宿主菌的構建與表達

將上述的重組質粒pET28a－MCRA轉化表達宿主E.coli BL21(DE3)，構建重組菌 pET28a－MCRA/E.coli BL21(DE3)。挑取能在含有Kana的LB平板上生長的菌落，擴大培養至OD600達到0.6時，添加IPTG至終濃度0.8mmol/L，20℃、200r/min誘導培養20h。將全細胞、上清和沉淀樣品進行SDS－PAGE檢測，同時以質粒pET28a轉化的pET28a/E.coli BL21(DE3)誘導表達產物作為空白對照。結果顯示目標蛋白基本都在沉淀部分，即包涵體。對IPTG濃度、誘導溫度等進行調整后，目標蛋白仍不可溶。后將誘導劑改為0.2%乳糖，20℃誘導20h后，按同樣方法處理，對所得全細胞、上清和沉淀樣品再次進行SDS－PAGE檢測，結果表明，在上清部分約67ku處有一條明顯的目標蛋白條帶(圖3)。SDS－PAGE分析細胞破碎的上清和沉淀，表明MCRA重組蛋白主要以胞內可溶形式存在。

2.4 重組蛋白MCRA的純化和鑒定

對鎳柱純化前及純化后的樣品，以及空白對照分別進行了SDS－PAGE分析，結果顯示目的條帶大小為約67ku(見圖4中A部分)，且純化后的蛋白條帶單一，Quantity one軟件分析表明純化后的蛋白純度大于95%。以BSA為標準樣品，Bradford法測定蛋白質濃度，結果表明經過一步純化后，最終可獲得34.4mg/L純化的MCRA重組蛋白。引物設計時保留了pET28a載體N端His－Tag標簽，即使得重組蛋白的N端帶有His－tag標簽，利用這個特點對空白對照，純化前及純化后的樣品進行了Western Blot分析，結果(見圖4中B部分)再次證實驗證了目標蛋白成功表達。

圖3 0.2%乳糖誘導的重組菌株蛋白的SDS－PAGE檢驗Fig.3 SDS－PAGE analysis of the proteins from recombinants with 0.2%lactose induction

圖4 重組菌株蛋白的SDS－PAGE和Western Blot分析Fig.4 SDS－PAGE analysis and Western Blotof the proteins from recombinants

2.5 重組蛋白MCRA酶活性的GC－MS檢測

在先前報道［12－13］的基礎上，利用亞油酸和油酸兩種底物對純化后的蛋白的活性進行了檢驗，結果顯示MCRA蛋白可對亞油酸和油酸分別進行羥基化。

以亞油酸為底物時，GC－MS的結果顯示在22.39min處有一產物峰(圖5A)，結合 MS結果及10－羥基－順－12－十八碳烯酸(10－HOE)的理論碎片(圖5B)等信息，可知產物就是10－羥基－順12－十八碳烯酸。以油酸為底物時在21.76min處有一個產物峰(圖6A)，MS結果及10－羥基－十八碳酸(10－HO)的理論碎片(圖6B)等信息，可知產物就是10－羥基－十八碳酸。

圖5 以亞油酸為底物GC－MS檢測結果Fig.5 GC－MS result:linoleic acid as a substrate

圖6 以油酸為底物GC－MS檢測結果Fig.6 GC－MS result:oleic acid as a substrate

GC－MS檢測結果顯示該蛋白不能催化亞油酸直接轉變為CLA，表明該蛋白并非亞油酸異構酶，這與 Rosson 等［9］，Volkov 等［12］和 Rosberg－Cody 等［13］報道是一致的，即以亞油酸、油酸為產物得到相應的羥基化衍生物，即肌球蛋白交叉反應抗原這類蛋白為催化CLA合成過程中的脂肪酸水合酶。本課題組先前的研究結果顯示，植物乳桿菌ZS2058在轉化LA產CLA的同時，積累大量的10－HOE，而MCRA蛋白催化了亞油酸至10－HOE的轉變，這也與Kishino等［7］人的研究結果相符合，因此植物乳桿菌ZS2058中MCRA即為催化產CLA第一步反應中的水合酶。

3 結論

本實驗成功的將L.plantarum ZS2058中的肌球蛋白交叉反應抗原基因MCRA在大腸桿菌中實現了可溶表達，活性檢驗結果顯示該蛋白可對亞油酸、油酸進行水合，將其轉變為相應的羥基化衍生物。本研究證實了植物乳桿菌ZS2058的MCRA蛋白僅起到水合酶的作用。根據先前文獻報道及本課題組的相關研究結果可知，該羥基化衍生物在乳酸菌中可進一步被催化轉變為CLA。本研究同時也為進一步擴大研究乳酸菌產CLA的機理研究奠定了理論基礎。

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