薄層及凝膠色譜法測(cè)定樹(shù)莓籽原花青素的平均聚合度

張佰清，閆冬雪

( 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，遼寧沈陽(yáng)110866)

隨著樹(shù)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，樹(shù)莓籽作為樹(shù)莓產(chǎn)品的副產(chǎn)物具有很高的利用價(jià)值，其中原花青素(PC)含量高達(dá)6.81～17.6mg/g。原花青素是可以在植物中提取出來(lái)的聚多酚類(lèi)混合物，屬于類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)，由數(shù)量不同的兒茶素和表兒茶素聚合而成［1-7］。據(jù)報(bào)道，低聚原花色素(OPCs)具有很強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，還有降血脂、抗癌等多種生物活性，在北美OPCs 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)［8］。除了原花青素含量是衡量原花青素質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)之外，聚合度也是一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)之一。由于高聚體的聚合度是難以測(cè)定的，因此我們經(jīng)常測(cè)定原花青素的平均聚合度。到現(xiàn)在為止，有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用來(lái)測(cè)定不同聚合度的原花青素，但是這些分析手段不僅儀器昂貴，也受到對(duì)照品的限制，不適合測(cè)定所有聚合度的原花青素［9-11］。本文通過(guò)薄層色譜法將原花青素中聚合度不同的組分分離運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)其成分進(jìn)行簡(jiǎn)單分析，并通過(guò)凝膠色譜法得到其平均聚合度，為進(jìn)一步研究樹(shù)莓籽原花青素的結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹(shù)莓籽 遼寧今日農(nóng)業(yè)有限公司，品種為秋紅;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，葡萄籽提物 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)公司;硅膠GF254國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;SephadexLH-20 上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司;乙腈、甲醇 為色譜純;其他試劑 均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 去離子水。

RE52-AA 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-2000 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) Unico 上海儀器有限公司;AL204 型萬(wàn)分之一天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;LD-500 搖擺式藥材粉碎機(jī) 長(zhǎng)沙常宏藥機(jī);CR21G 高速冷凍離心機(jī) Hitachi High-Technologies Corporation;DHL-A 電腦恒流泵、HD-3 紫外檢測(cè)儀 上海滬西分析儀器廠;真空干燥箱 天津?qū)嶒?yàn)儀器廠;Lab Workstation 2006 型高效液相色譜儀 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法 樹(shù)莓籽用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)篩，加入石油醚脫脂后抽濾，將樹(shù)莓籽真空干燥后加入乙醇，超聲波輔助提取樹(shù)莓籽原花青素，離心得到粗提液［1］。

1.2.2 含量測(cè)定方法 采用香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素含量，1mL 待測(cè)液添加入6mL 4%香草醛甲醇溶液和3mL 濃鹽酸，在避光(20℃)的條件下反應(yīng)15h 測(cè)定吸光度，計(jì)算原花青素含量［12］。

1.2.3 分離提純方法 樹(shù)莓籽原花青素粗提液經(jīng)真空濃縮后用HPD100C 大孔樹(shù)脂進(jìn)行初步的分離提純，洗脫液真空濃縮達(dá)到一定的濃度后通過(guò)薄層色譜法進(jìn)一步的分離，通過(guò)Rf 值(薄層色譜法中原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)到溶劑前沿的距離的比值)判斷層析效果［13-14］。

展開(kāi)溶劑的選擇:展開(kāi)體系1:v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(甲酸)=3∶6∶1;展開(kāi)體系2:v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(乙酸)=3∶4∶1;展開(kāi)體系3:v(甲苯)∶v(氯仿)∶v(丙酮)=4∶2.5∶3.5;展開(kāi)體系4:v(乙酸乙酯)∶v(丙酮)∶v(甲酸)∶v(水)=5∶3∶3∶1.

點(diǎn)樣量的選擇:配制4mg/mL 的原花青素溶液，選擇1、5、10、15、20、25μL 使用毛細(xì)管點(diǎn)樣，確定點(diǎn)樣量。

1.2.4 分析方法 將通過(guò)薄層色譜分離開(kāi)的色帶刮下帶有樣品的硅膠，用甲醇洗脫，離心得上清液，真空干燥后分別將分離開(kāi)的三條譜帶配制成甲醇溶液，用HPLC 進(jìn)行分析［15］。

液相色譜條件流動(dòng)相:A 為2%冰醋酸;B 為乙腈∶水∶冰醋酸(80∶19.6∶0.4);檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;流速:1.0 mL/min;色譜柱:反相C18柱;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.5 平均聚合度測(cè)定方法 通過(guò)凝膠色譜法［4］進(jìn)行測(cè)定，用不同分子量的聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品以分子量為橫坐標(biāo)，保留時(shí)間為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將分離產(chǎn)物溶解后上樣于SPehadexLH-20 柱中，用8mol/L尿素-60%丙酮(4∶6)溶液以0.5mL/min 的流速進(jìn)行洗脫，每隔5min 收集一管。按照標(biāo)準(zhǔn)方程得到相對(duì)分子質(zhì)量，計(jì)算平均聚合度。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法分離樹(shù)莓籽原花青素

2.1.1 展開(kāi)劑的選擇 由表1 可以看出展開(kāi)體系1、2 可以使譜帶有效分離，而展開(kāi)體系3 無(wú)分離，說(shuō)明溶劑的極性過(guò)小。展開(kāi)體系4 譜帶無(wú)有效分離而斑點(diǎn)均聚集在層析板上緣，說(shuō)明該展開(kāi)體系的極性過(guò)大。展開(kāi)體系1 雖然可以將譜帶分開(kāi)，但是Rf 值比較接近，因此選擇分離效果較好的展開(kāi)體系2 作為最佳展開(kāi)劑。

表1 各展開(kāi)體系的Rf 值Table 1 Rf of different expansion system

2.1.2 點(diǎn)樣量的選擇 由表2 得出，當(dāng)點(diǎn)樣量大于20μL 時(shí)譜帶Ⅰ、Ⅱ無(wú)法有效分離，說(shuō)明已經(jīng)超載。在點(diǎn)樣量為15μL 時(shí)譜帶距離較近，但是仍然可以有效分離，因此選擇15μL 為最佳點(diǎn)樣量。

2.2 HPLC 分析分離產(chǎn)物

圖1～圖3 為經(jīng)過(guò)HPLC 分離得到的圖譜。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of proanthocyanidin standards

圖2 薄層譜帶Ⅰ的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of the TLC colour zone Ⅰ

圖3 薄層譜帶Ⅱ的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC of the TLC colour zone Ⅱ

以上實(shí)驗(yàn)得到的分析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 圖譜比較，由圖1 看出譜帶Ⅰ是由沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素(保留時(shí)間分別為8.065、20.021、33.892min)的單體物質(zhì)構(gòu)成。由圖2 可以確定譜帶Ⅱ中的一種B2(保留時(shí)間為31.573min)。譜帶Ⅱ、Ⅲ的低聚體、高聚體組分非常復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步研究。

2.3 平均聚合度的測(cè)定

由于對(duì)原花青素高聚體的定性和定量是比較困難的，因此測(cè)定平均聚合度成為分析原花青素常用的方法。凝膠滲透色譜實(shí)際上是一種分子排阻色譜，研究發(fā)現(xiàn)可以采用此方法測(cè)定原花青素的聚合度。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫曲線(xiàn)和分子排阻方程以分子量為橫坐標(biāo)，時(shí)間為縱坐標(biāo)建立二者的相關(guān)方程，如圖4 所示。

圖4 薄層譜帶Ⅲ的HPLC 圖譜Fig.4 HPLC of the TLC colour zone Ⅲ

圖5 為薄層分離得到的三條譜帶的凝膠色譜圖，由圖中各譜帶的保留時(shí)間，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出譜帶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均分子量分別為269，714 和1375。由HPLC 知譜帶Ⅰ主要為兒茶素和表兒茶素為單體成分的物質(zhì)，因此可推算出Ⅱ、Ⅲ的平均聚合度分別為2.65 和5.11。同時(shí)在凝膠色譜圖中看到，三個(gè)譜帶的洗脫圖形有所不同。譜帶Ⅰ圖形比較尖銳，說(shuō)明其分子構(gòu)成簡(jiǎn)單。但譜帶Ⅲ的曲線(xiàn)拖尾現(xiàn)象十分明顯，這種拖尾現(xiàn)象可能是其產(chǎn)物構(gòu)成較為復(fù)雜和多樣，也可能是由于分級(jí)洗脫不夠徹底造成的。

圖5 聚苯乙烯分子量與保留時(shí)間的關(guān)系Fig.5 The coreralationship between molecular weight of polystyrene and retention time

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，展開(kāi)劑為v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(乙酸)=3∶4∶1，樣品濃度4mg/mL，點(diǎn)樣量15μL 時(shí)，薄層色譜對(duì)樹(shù)莓籽原花青素分離效果最佳。HPLC 譜帶分析表明樹(shù)莓籽原花青素為多聚體混合物，通過(guò)凝膠色譜法測(cè)定三條譜帶的平均聚合度，得出譜帶Ⅰ單體物質(zhì)為1，可以確定其組分包括沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素，譜帶Ⅱ中包括一種二聚體，平均聚合度為2.65，譜帶Ⅲ的組分最為復(fù)雜，平均聚合度為5.11。由于各種異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)、種類(lèi)非常復(fù)雜，各組分出峰有待進(jìn)一步探討。

圖6 各譜帶的凝膠色譜圖Fig.6 The chromatogram of Sephadex LH-20 gel permeation chromatography

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