高產EPS 乳酸菌株的篩選及在農家干酪中的應用

劉麗波，孫 迪，谷春濤，趙 鋒，徐 漸，周元良

( 東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的一類水溶性糖類化合物［1］。按其所在位置的不同分為莢膜多糖和粘液多糖［2］，也可以根據多糖的組成不同將其分為同型多糖(HoPSs)和異型多糖(HePSs)［3］。乳酸菌EPS 是一種天然的、具有諸多生理功能的生物高分子聚合物，能夠粘合在細胞的表面，可以作為細胞膜的保護屏障，同時也是生物膜的組成成分。然而，EPS 的產量很低，只有少數EPS 被開發應用［4］，如黃原膠、硬葡聚糖、凝膠多糖已作為食品添加劑應用于食品行業中。另外，細菌纖維素作為化妝品乳化穩定劑被應用于非食品行業［5］。近年來研究發現，一些乳酸菌菌株如德氏保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌釋放的HePSs，能夠提高干酪的保水性，同時能夠在不改變干酪結構的前提下改善干酪的整體質地［6］。Perry 等研究發現［7］，利用高產EPS 菌株能夠得到低脂的意大利白干酪，在降低終產品熱量的基礎上改善奶酪的質地。不僅如此，添加產EPS菌株(如嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌屬的菌株)有助于改善低脂干酪的流變學特性［8］。產EPS 的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株可以在Cheddar 干酪成熟期間對干酪的質地和微觀結構產生有利的影響，從而改善Cheddar 干酪的功能特性［9］。但是目前還沒有研究將高產EPS 菌株應用到農家干酪中，確定其在不同條件下對農家干酪品質的影響。本研究首先從8 株嗜熱鏈球菌和8 株保加利亞乳桿菌中篩選出高產EPS 菌株，然后將其應用到農家干酪生產中，研究在不同的加工條件下，菌株對農家干酪品質的影響，對低脂干酪生產和質量改進提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌8 株，編號為S0，MHQ，S7，S3.3，S3.6，S3.1，S3.7，S4、保加利亞乳桿菌8 株，編號為WK，JB，KD2，KD5，KD3，LTM，L2，L6均由乳品科學教育部重點實驗室(東北農業大學)保藏;脫脂乳培養基、改良M17 培養基、改良MRS 培養基 各成分按照文獻進行配制［10］;所用試劑為實驗室常規分析純化學試劑。

Beckman 25R 低溫冷凍離心機 美國貝克曼;冷凍干燥機 上海醫用儀器廠;無菌操作臺 蘇州醫用器械廠;TA.XT.Plus 物性測試儀 英國Stable Micro Systems 公司;DK-8K 恒溫水浴鍋 北京瑞利;DGF25012C 臺式電熱鼓風干燥箱 北京東聯哈爾儀器制造;全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss 公司;干酪槽等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離與純化 在無菌條件下將上述16 株乳酸菌少許接入到12%(w/v)的脫脂乳中，37℃培養，待凝固且無乳清析出時取出放入4℃保存。將上述16 株菌繼續用12%(w/v)的脫脂乳傳代培養約3次，至凝乳時間5～6h 停止活化培養，記錄凝乳時間，放入4℃儲存備用。將活化好的8 株嗜熱鏈球菌接種到pH6.5 改良M17 培養基平板上培養，8 株保加利亞乳桿菌接種到pH6.0 改良MRS 培養基平板上培養，平板上長出單個菌落后，進行革蘭氏染色鏡檢，確定是否為純菌株，如有雜菌混入可進一步純化。挑取鏡檢后的單一菌落接入液體培養基37℃培養。

1.2.2 高產EPS 菌株的篩選 經MRS 液體培養基活化后的16 株乳酸菌，分別按接種量3% 接入100mL MRS 液體培養基中，37℃培養48h 后，10000×g 離心10min 除菌體，上清液濃縮至原體積的1/5后加入等體積的40%三氯乙酸沉淀并去除蛋白，得到的上清液中加入3 倍95%乙醇沉淀多糖，12h 后，在12000 ×g，30min 離心收集沉淀，溫水溶解沉淀，去離子水透析48h，透析液稱量、定容、稀釋后，用苯酚-硫酸法測定多糖合成量。以乳酸菌EPS 的合成量作為菌株篩選的指標。嗜熱鏈球菌培養基采用pH6.5 改良M17 培養基，保加利亞乳桿菌采用pH6.0改良MRS 培養基。

1.2.3 苯酚—硫酸法測定多糖合成量 精密稱取于105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1468g，置于250mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液3.0、5.0、7.0、9.0、11.0mL 分別置于50mL 容量瓶中以去離子水稀釋至刻度搖勻，即得標準溶液。分別精密吸取上述標液2.0mL，加苯酚1.0mL，然后迅速再加入5.0mL 濃硫酸，搖勻放置5min，后置100℃水浴15min 取出冷卻至室溫。于490nm 測定吸光度得回歸方程。另以去離子水加苯酚和濃硫酸試劑同上操作為空白對照。樣品經分離得多糖后，于200mL 容量瓶定容，取樣品2mL 后，同標準曲線的操作，測定吸光度后查標準曲線得多糖濃度，再乘以稀釋倍數，即得上清液中多糖的合成量。

1.2.4 農家干酪加工工藝 脫脂乳→標準化→均質→殺菌→冷卻(30～32℃) →發酵劑→氯化鈣→凝乳酶→切割→攪拌→加熱→排乳清→水洗→瀝干→拌鹽(1%) →成品

實驗添加4% 液態發酵劑(保加利亞乳桿菌L6∶嗜熱鏈球菌S7∶保加利亞乳桿菌LTM∶乳酸乳球菌=1∶1 ∶1 ∶1)，在前期研究中發現此比例合成較高EPS。發酵溫度為32℃，發酵時間為1h。

1.2.5 添加高產EPS 菌株在不同條件下對農家干酪品質的影響

1.2.5.1 稀奶油添加量對農家干酪品質的影響 分別配制1L 固形物含量為11%，脂肪含量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的脫脂乳。實驗中所用脫脂乳粉的脂肪含量為1.5g/100g，稀奶油的脂肪含量為35.5g/100g。通過計算稀奶油添加量為2.4%、3.8%、5.2%、6.7% 和8.1%，脫脂乳粉添加量為10.1%、9.6%、9.1%、8.5%和8.0%。通過對農家干酪的含水量、蛋白質含量和硬度的測定，確定最佳稀奶油添加量。

1.2.5.2 不同熱處理條件對農家干酪品質的影響分別 用 63℃、30min;72℃、15min;85℃、15min;100℃、8min 和115℃、8min 的熱處理條件對原料乳進行殺菌。通過對農家干酪的含水量、蛋白質含量和硬度的測定，確定熱處理的最適條件。

1.2.5.3 不同氯化鈣添加量對干酪品質的影響 在農家干酪的制作工藝中，分別加入0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%的氯化鈣，通過不同氯化鈣添加量對農家干酪含水量、蛋白質含量和硬度的影響，確定最適氯化鈣添加量。

1.2.6 實驗指標測定

1.2.6.1 農家干酪含水量的測定 取少量成品干酪，切碎后準確稱量5g 碎樣于平皿內，置于干燥箱內，溫度設置為100～105℃，烘干至恒重后，測量總質量，通過質量差計算出干酪的含水量。

1.2.6.2 農家干酪蛋白質含量的測定 利用國家標準［11］中凱氏定氮法測定農家干酪的蛋白質含量。

1.2.6.3 農家干酪質構特性的測定 將一塊干酪的上下和邊緣5mm 的部分去掉，樣品室溫下放置30min。利用質構儀來測定干酪的硬度。質構儀參數如下:測定模式:力/張力;測試前速度:1.00mm/s;測試速度:1.00mm/s;測試后速度:1.00mm/s;下壓距離:30%;探頭型號:P/0.5 DIA Cylinder Ebonite［12］。

1.2.6.4 農家干酪的感官評價 感官評定在食品工藝室內完成，邀請10 名從事本專業方向的研究人員組成評定小組，從風味、質地、外觀等方面進行感官評定和感官評分［13］，具體的感官評分標準見表1。

2 結果與分析

2.1 不同菌株EPS 合成量的測定

2.1.1 苯酚—硫酸法測定EPS 合成量的標準曲線苯酚—硫酸法測定多糖合成量標準曲線如下，回歸方程為:y =6.2061x-0.0018，R2=0.9991。

2.1.2 嗜熱鏈球菌EPS 合成量的測定 8 株球菌分別在100mL 液體培養基中培養48h，培養溫度37℃，球菌初始pH 為6.5，不同菌株多糖合成量，以mg/L表示。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation index

圖1 胞外多糖測定標準曲線Fig.1 Standard curve of determining EPS

從表2 可以看出S3.3，S3.6，MHQ，S7的4 株球菌多糖合成量較高，適合于進一步優化進行驗證，實驗結果如表3 所示。

表2 嗜熱鏈球菌多糖合成量Table 2 The EPS production by S.thermophilus

表3 嗜熱鏈球菌優選菌株驗證實驗結果Table 3 The result of test for S.thermophilus

驗證實驗結果表明嗜熱鏈球菌S7是在8 株嗜熱鏈球菌中EPS 合成量最高的菌株，合成量可達56.25mg/L，適合作為高產EPS 菌株繼續進行農家干酪的研究。

2.1.3 保加利亞乳桿菌EPS 合成量的測定 受試的保加利亞乳桿菌共8 株，分別命名為WK，JB，KD2，KD5，KD3，LTM，L2，L6，將8 株保加利亞乳桿菌接入100mL 液體培養基中培養48h，培養溫度37℃，初始pH 均為6.0，測得不同菌株多糖合成量，以mg/L 表示。

從表4 可以看出，保加利亞乳桿菌WK，JB，KD2，KD5，KD3多糖合成量不高，而保加利亞乳桿菌L2，L6，LTM 多糖的合成量都較高且相差結果不大，需通過驗證實驗進一步確定最適菌株，結果如表5。

表4 保加利亞乳桿菌多糖合成量Table 4 The EPS production by L.bulgaricus

表5 保加利亞乳桿菌優選菌株驗證實驗結果Table 5 The result of test for L.bulgaricus

驗證實驗也表明菌株L6多糖合成量最高，合成量可達到51.53mg/L，L2和LTM 合成量也達到50mg/L，但LTM 合成量較高，接近于L6菌株EPS 合成量，所以菌株L6和LTM 適合作為高產EPS 菌株繼續進行農家干酪的研究。

以上實驗結果表明在同樣的培養條件下，嗜熱鏈球菌S7和保加利亞乳桿菌L6、LTM 在MRS 液體培養基中的EPS 合成量較高，將用于進一步農家干酪的研究。

2.2 不同稀奶油添加量對農家干酪品質的影響

不同稀奶油添加量對農家干酪的含水量、蛋白質含量和硬度的影響如圖2。從圖中可以看出，對于干酪水分的影響，隨著稀奶油添加量的增大，干酪的水分含量明顯增加，當脂肪含量達到2.5%時，干酪含水量達到峰值67.1%，但過多的稀奶油反而會使干酪含水量降低;而相對于干酪蛋白質含量來說，隨著稀奶油添加量的增大，干酪中蛋白質的含量逐漸減少，脂肪含量為1% 時，干酪蛋白含量最多為17.00%，脂肪含量為3%時，干酪的蛋白含量最少為12.05%;同時，隨著稀奶油添加量的增大，干酪的硬度逐漸降低，脂肪含量從1%提升到2%時，下降趨勢明顯，而脂肪含量從2.5%到3%時，下降趨勢緩和。

圖2 不同稀奶油添加條件對干酪品質的影響Fig.2 Effect of different content of cream on quality of cheese

2.3 不同熱處理條件對農家干酪品質的影響

不同熱處理條件對農家干酪的含水量、蛋白質含量和硬度的影響如圖3。結果表明，隨著熱處理強度的加大，干酪含水量逐漸增加，當熱處理條件為115℃8min 時，干酪含水量達到峰值65.7%，但是過高的熱處理溫度對蛋白質的影響就會比較大;從熱處理條件對蛋白質含量的影響就可以看出，當熱處理條件逐漸加強時，干酪的蛋白質含量逐漸增加，熱處理條件為100℃8min 時最高，達到17.2%，但當熱處理條件為115℃8min 時，干酪中蛋白質含量反而降低;從干酪的硬度結果可以看出，隨著熱處理條件的加大，干酪的硬度呈降低趨勢，當熱處理條件為85℃15min 時硬度最低，100℃8min 時稍有提高，當強度進一步增大時，硬度又再次降低。

2.4 不同氯化鈣添加量對農家干酪品質的影響

圖3 不同熱處理條件對干酪品質的影響Fig.3 Effect of different heat treatment conditions on quality of cheese

由圖4 可以看出，在一定范圍內，隨著氯化鈣添加量的增大，農家干酪的含水量逐漸降低。當氯化鈣的添加量從0.01%增加至0.03%時，產品含水量大幅下降，而后則趨于平穩。同時，隨著氯化鈣添加量的增大，農家干酪的蛋白質含量逐漸降低。其中，氯化鈣添加量為0.01%時產品蛋白質含量最高。對于干酪的硬度來說，隨著氯化鈣添加量的增大，農家干酪的硬度先增大后減小，在添加量為0.05%時硬度達到最大值，而添加量為0.01%時為最小值。這是由于Ca2+能夠影響凝乳酶的反應速度，適量添加氯化鈣能夠加速凝乳過程，提高干酪的硬度和彈性。Ca2+濃度較低時，凝乳速度慢，形成的凝塊含水量高，質地也較軟;隨著氯化鈣添加量的增大，產品硬度會相應提高，超出一定范圍后，則會對干酪的感官狀態與品質產生不利影響。

2.5 感官評價

通過感官評價，可以得出的結論是，隨著稀奶油添加量的增大，干酪的風味明顯呈上升趨勢。當稀奶油添加量為5.2%時，農家干酪感官評分最高，而當添加量繼續增加時，干酪的風味略有降低，在添加量為8.1%時，干酪的感官評價相對較差。另外，隨著熱處理強度的加大，干酪的質地逐漸變柔軟，硬度逐漸下降，當熱處理條件為72℃15min 時，干酪的感官評價最高，隨著熱處理強度的進一步加大，干酪的質地會過于疏松，易碎。不僅如此，隨著熱處理強度增加，干酪的光澤度也逐漸增加。對于氯化鈣的添加量來說，當添加量為0.01%時，干酪的各項評分最高。隨著添加量的不斷增加，干酪的硬度也隨之增加，使農家干酪的質地堅硬，風味變差，但色澤變化不明顯。

圖4 不同氯化鈣添加量對干酪品質的影響Fig.4 Effect of different amount of CaCl2 on quality of cheese

表6 不同因素對干酪感官評價的影響Table 6 Effect of different factors on sensory evaluation of cheese

3 結論

在本實驗中，同樣的培養條件下，嗜熱鏈球菌S7和保加利亞乳桿菌L6、LTM 在MRS 液體培養基中的EPS 合成量較高，適合進一步用于農家干酪的研究。本實驗中不同稀奶油添加量、熱處理條件和氯化鈣添加量對農家干酪品質影響的研究結果表明，以感官評定值為主指標，結合含水量、蛋白質含量和硬度指標，確定當稀奶油添加量為5.2%、熱處理條件為72℃15min、氯化鈣添加量為0.01%時，用高產EPS菌株生產所得的農家干酪品質最佳，符合國家農業部軟質干酪的標準，可應用于農家干酪的生產。

［1］鐘顏麟，彭志英，趙謀明.乳酸菌胞外多糖的研究［J］.中國乳品工業，1999，27(4) ：7-9.

［2］Petronella J，Looijesteijn，Lionel Trapet，et al.Physiological function of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis［J］. Int J of Food Microbiol，2001，64：71-80.

［3］趙玉臣，王迎俊，王忠鳳.乳酸菌胞外多糖［J］.中國乳業，2003(4) ：32-35.

［4］Suresh Kumar A，Mody K，Jha B.Bacterial exopolysaccharides-a perception［J］.J Basic Microbiol，2007，47：103-117.

［5］顧瑞霞.乳酸菌抗腫瘤特性的研究進展［J］.中國微生態學雜志，1999，11(4) ：253.

［6］Zisu B，Shah NP. Texture characteristics and pizza bake properties of low-fat mozzarella cheese as influenced by preacidification with citric acid and use of encapsulated and ropy exopolysaccharide producing cultures［J］.Int Dairy J，2007，17：985-997.

［7］ Perry DB，Mc Mahon DJ，Oberg CJ. Effect of exopolysaccharide-producing cultures on moisture retention in low fat mozzarella cheese［J］.J Dairy Sci，1997，80：799-805.

［8］Tunick MH，Van Hekken DL，Malin EL.Low-fat Cheddar cheese［A］.In： Proceedings of the 7th Cheese Symposium.Cork，Ire land.2003，79-86.

［9］Dabour N，Kheadr E，Benhamou N，et al.Improvement of texture and struc ture of reduced - fat Cheddar cheese by exopolysaccharide-producing lactococci［J］.J Dairy Sci，2006，89：95-110.

［10］凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1999，36.

［11］GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》

［12］Drake MA，Gerard PD，Truong VD，et al. Relationship between instrumental and sensory measurements of cheese texture［J］.J Texture Studies，1999，30(4) ：451-476.

［13］Toba T，Uitoshi H，Mukai T，et al.A New Fermented milk usingcapsularpolysaccharideproducinglactobacillus kefiranofaciens isolated from kefir grains［J］.J Dairy Res，1991，58(4) ：497-502.