電解刺激技術對E.dissolvens 生長代謝的研究

宋 波，侯怡鈴，丁 祥

( 西華師范大學生命科學學院，四川南充637002)

微生物細胞的電解刺激培養是電化學與生物工程交叉領域的一個重要課題，近年來受到研究者日益增長的關注。這一技術利用直流電或交流電在液相或泥漿體系中引發電極反應，從而達到促進細胞生長及活性的目的。目前已成功應用于酵母發酵［1］、生物脫氮［2］以及鐵細菌［3］E.dissolvens［4-5］等微生物的培養過程。如楊金水等［6］研究了弱直流電場條件對銅綠假單胞菌的影響，表明不同的電流可改變細胞通透。此外直流電和交流電的電場刺激對大腸桿菌和phanerochaete chrysosporium 蛋白的表達和酶活通透性等都有影響［7-8］。但一直以來，微生物的電解刺激技術多關注于外加電場對細胞的培養過程的研究，而對于直流電和交流電產生的不同效應沒有進行深入的研究。本文將腸細菌E.dissolvens 的電解刺激培養過程進一步拓展至直、交流電條件下，檢測細胞生長、活性以及底物代謝等方面變化，并與直流電條件下所取得相關結果進行對比外，也考察了兩種電流條件下電解水產生羥基自由基和過氧化氫等中間產物的能力差異。其結果有助于增進對于直、交流電解刺激過程的認識，同時也是前期所開展直流電解刺激研究的有益補充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用細菌 油田污染水樣。通過以菲為唯一碳源進行限制性培養后純化獲得。該菌經測試最終鑒定為腸桿菌Enterobacter dissolvens，屬革蘭氏陰性菌。該細菌也能降解葡萄糖將此菌培養在以葡萄糖為唯一碳源條件下進行，培養基中同時添加常用無機鹽類，濃度分別為(g/L 去離子水):葡萄糖15，K2HPO40.8，KH2PO40.2，NH4NO30.8，MgSO40.25，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl20.032。進行電解刺激實驗之前，首先對E.dissolvens 進行預培養［9］以獲取具有較高活力的純菌液，具體步驟為:從-25℃低溫冰箱中保存的甘油管中取出0.1mL 種子菌液，接種至盛有150mL 經過濾滅菌培養基的三角瓶(500mL 容積)中，于30℃恒溫搖床(150r/min)中培養約10h。葡萄糖 北京益利精細化學品有限公司，分析純;DNS、TTC、RNO Sigma，分析純;其余試劑均為分析純。

DYY-III 2 直流電電泳儀 北京六一儀器廠;交流電變頻電源 艾諾儀器公司。

1.2 電解刺激實驗裝置

直流及交流電解刺激實驗在如圖1 所示的玻璃電解瓶中進行，瓶體為兩層玻璃層，內層裝細菌液，容積為100mL;外層通水以保持恒溫。兩根鉑絲(直徑0.2mm)從頂端插入并沿對稱方向固定在內層的兩側作為電極。實驗前將3 個完全一致的電解瓶及其他實驗材料經高壓蒸汽滅菌，然后將經過預培養的300mL 菌液平均分為三份，分別轉移至各個電解瓶，1 個不加電用作參比，另2 個分別施加直流電和交流電進行電解刺激實驗。實驗時三個電解瓶內分別放置一個完全相同的磁力轉子，并置于一臺多頭磁力攪拌器上以恒定速率進行攪拌，從而保持瓶內菌液的均勻混合［4］。

圖1 細胞電解瓶實驗裝置圖Fig.1 Schematic diagram of the electrolytic vessel

1.3 電極水解反應中間產物分析

電解刺激過程中·OH(羥基自由基)和H2O2(過氧化氫)兩種水解中間產物的檢測根據Wabner 等提供的方法修改而來［10］。其原理是利用對亞硝基二甲基苯胺(RNO)作為捕捉試劑在中性溶液中與·OH 進行選擇性反應，而使自身所帶黃色逐漸褪去。這一變化可通過測量溶液在440nm 處的吸光度(OD440)進行實時監測。H2O2則利用外加Fe2+離子轉化為·OH后(Fenton 反應［11］)，同樣通過監測溶液的OD440變化進行確定。以上實驗的具體操作，分述如下:

1.3.1 ·OH 含量分析 在圖1 所示電解瓶中加入100mL 含有RNO(50μmol/L)的磷酸鹽緩沖液，其K2HPO4與KH2PO4含量與前述細菌培養基相同。電流通過從頂端沿對稱方向插入的鉑片電極(陽極，1cm2)和鉑絲電極(陰極)施加。加電后利用蠕動泵將溶液從電解瓶中以恒定流速抽出，在經過1 臺配有流動池的分光光度計(Agilent 8453 UV-Visible Spectrophotometer)后回流至電解瓶中。因此不同時刻測得OD440值與初始吸光度值進行比較，即可計算出溶液中RNO 的殘余百分比，其變化斜率可反映出溶液中·OH 的產生情況。

1.3.2 H2O2含量分析 實驗操作與·OH 的分析步驟相同，只是磷酸鹽緩沖液中除加入RNO 外，同時加入了0.1mmol/L 的FeSO4。因此在相同電流條件下比較加入Fe2+離子與不加Fe2+離子所獲得的RNO降解速率，可以判定溶液中是否有額外·OH 生成，進而判斷H2O2的產生情況。

1.3.3 細胞脫氫酶活測定 采用TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)顯色法進行。每隔2h 取樣一次，測定脫氫酶時，取20mL 的試管，分別加入1mL TTC 溶液(0.5%)，Tris-鹽酸緩沖液(pH8.4)，葡萄糖溶液(0.1mol/L)和1mL 的樣品液?；靹蚝蠓庞?0℃恒溫培養箱中溫育3h，然后滴入2 滴濃硫酸以終止反應。加入5mL 甲苯萃取酶促反應生成的紅色產物TPF(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride formazan)，并以純甲苯為參比于490nm 波長處測定萃取液的吸光度(A490)。

1.3.4 氧化還原電位測定 采用氧化還原電極(Pt4865-50-S7，Mettler Toledo)測定。

1.3.5 其他參數的測定 在10mA 條件下平行開展了細胞的交、直流電解刺激培養實驗。監測了細胞菌濃、殘糖濃度、溶液物化性質(pH 和氧化還原電位)諸參數隨時間的變化情況。

2 結果與討論

2.1 細胞的交、直流電解刺激培養過程研究

為便于比較，以上結果均顯示于圖2、圖3 中，并分為參比、直流以及交流三組進行對比。

圖2 細胞菌濃隨電流的變化Fig.2 Time course profiles of the cell growth

圖3 細胞比脫氫酶活性隨電流的變化Fig.3 Time course profiles of cell dehydrogenase activity

圖2 所示為細胞菌濃隨時間的變化。與不加電的參比樣(Control)相比，受直流電作用細胞的生長周期明顯提前，約5h 后進入平臺生長期，10h 后開始逐漸下降。與此形成對照的是，交流電的施加未導致細胞生長出現明顯變化，只在后期略有增長。但是值得注意的是在直流電刺激下，細胞的生長提前進入了衰亡期。細胞脫氫酶活的變化如圖3 所示:施加直流電和交流電均導致細胞脫氫酶活升高，但直流電的刺激效果更為明顯。在電刺激12h時刻，受直流電刺激細胞的比脫氫酶活(總顯色度(OD490)/細胞菌濃(OD600))較參比值提高了0.9倍，而交流電條件下這一增幅為0.3 倍。但在12h之后，交、直流電流作用下細胞的脫氫酶活變化趨勢體現出顯著的差異，前者停止增長而逐漸走平，與參比一致;后者則出現急劇下降，與圖2 中所示同時期菌濃的下降形成對應。圖4 所示為菌液中殘糖濃度隨時間的變化，可以看出直流電條件下葡萄糖的降解速度最快，交流電次之，但略強于參比值。這一結果與細胞生長及脫氫酶活的變化規律相一致，表明細胞菌濃與活力的提升的確可以加快底物代謝。

圖4 細胞葡萄糖含量隨電流的變化Fig.4 Time course profiles of residual glucose

2.2 細胞的交、直流電解刺激對生長環境的影響

細胞培養過程中也對菌液的pH 和氧化還原電位(Eh)進行了監測，分別如圖5 和圖6 所示。細胞培養過程中參比菌液的pH 持續下降，原因估計為葡萄糖受腸桿菌代謝時生成的有機酸所致［1］。與之相比，直流電解條件下pH 下降更為快速，而交流電解條件下菌液pH 未出現明顯差異，表明兩種電流條件下菌液中酸性物質的累積濃度具有差異。氧化還原性方面，加電與參比菌液的Eh 值均呈現出先下降后上升的特征，其中參比菌液中Eh 值的下降應主要由于菌液中的溶氧限制所致(采用溶氧電極測得的溶氧值始終為0)，而加電條件下的Eh 值則明顯受到了電極反應的影響:受電解菌液的Eh 值在加電后急劇降低，并在整個培養周期內顯著低于參比菌液。由于前期在同一實驗體系中已經利用循環伏安法鑒別出水解反應為主要電極反應，且菌液Eh 值的降低主要由陰極生成的氫氣所導致，因此以上結果表明，交流電解刺激培養與直流電解刺激培養在過程機理具有相似性，其實質均是利用水解反應影響細胞生長及活性，但在同等電流強度下，交流電激發電極反應的能力弱于直流電。

圖5 pH 隨時間的變化Fig.5 Time course profiles of pH

圖6 氧化還原電位隨時間的變化Fig.6 Time course profiles of redox potential

2.3 交、直流條件下水的電解中間產物分析

電解水反應的終產物是氫氣和氧氣。Sanetaka等人研究了直流電條件下的水電解反應過程，發現其中同時伴隨生成H2O2和·OH 等氧化性中間產物［12］，而這些中間產物對細胞的生理活性具有抑制性作用。但對于交、直流電解水反應之間的潛在差異，目前尚未見文獻明確報道。為此我們采用同樣利用亞硝基二甲基苯胺(RNO)作為電子捕捉試劑［10］，分別在同電流和同電壓兩種條件下考察了交、直流電解水反應過程中鉑電極上H2O2和·OH 的產生情況，結果如圖7 所示。

由圖7(a)可以看出，在直流電刺激下，即使是1V 的電壓下，隨著刺激時間的增加，電極產物對RNO 的降解率逐漸提高。比較兩個發生電極反應的溶液，在電刺激的前5min，溶液中有無FeSO4沒有明顯的差異，溶液中RNO 的降解率均為5%左右，這說明了溶液中沒有H2O2產生;值得注意的是在電刺激20min 左右，沒有添加FeSO4的溶液的降解率是13%，而添加了FeSO4的降解率是17%左右，這充分說明了在直流電的刺激下，含FeSO4的溶液中產生了H2O2，而H2O2對細胞有毒害作用，正是由于過多的H2O2的產生，所以在細菌生長的后期，電流下對細菌的刺激效應表現為殺菌的效應。

同時對照交流電下的電極反應圖7(b)可以發現，在1V 的電壓刺激下，幾乎沒有電極反應發生，在溶液中添加FeSO4和不添加FeSO4對RNO 幾乎都沒有明顯的降解率，這說明，在低電壓下，交流電刺激，不足以產生電極反應。而當電壓強度增加到5V 時，從圖7(c)可以看出，對RNO 的降解率隨著刺激時間的加長逐漸上升。在20min 時達到7%左右的降解率，這充分說明了5V 電壓下溶液發生了電極反應。同時發現，添加FeSO4和不添加FeSO4的溶液對RNO 的降解率沒有明顯的差異，這一點暗示了交流電刺激下溶液中沒有產生H2O2。

圖7 利用鉑電極進行細胞外加電場電解培養時的電極反應產物分析圖Fig.7 Time course profiles of the analysis of electro analysis direct current

比較整個外加電場對細菌的電刺激情況，可以清楚地認識到直流電和交流電的電極產物是不同的，直流電的電極產物中·OH，O2和H2O2而交流電的產物中僅含有·OH，O2并沒有H2O2，這一點似乎可以解釋直流電和交流電10mA 電流下，對細菌Enterobacter dissolvens 生長和代謝的不同。直流電刺激的后期產生的H2O2對細胞產生毒害作用，最終導致了細胞的死亡。

3 結論與展望

在細菌E.dissolvens 的批式培養過程中，應用直流電和交流電均能對細胞的生長及脫氫酶活產生正面刺激作用，且在相同電流強度下直流電的刺激效果顯著強于交流電。對于平臺期細胞，施加直流電亦導致了細胞結構和活性出現明顯受損和下降，而采用交流電則未體現出這一抑菌作用。對·OH 和H2O2兩種電解水中間產物的檢測表明，交流電產生以上抑菌性物質的能力遠低于直流電，這可能是兩種電流對細胞培養過程的影響出現差異的主要原因。

目前關于微生物細胞的電解刺激培養研究大多采用直流電進行，對于交流電應用于此過程的可行性和效果尚未見相關文獻報道。根據本文結果可以看出，同等強度下交流電與直流電相比，在激發電極反應的效能方面具有劣勢，但交流電解水過程中由于不生成H2O2等有害中間產物，對細胞不會產生明顯的損傷作用，對于具有較長生長周期的微生物細胞培養過程具有一定應用潛力。

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