定量PCR檢測激光切割的若干細胞中基因NGF轉錄本

黃國韋

（汕頭大學 醫學院病理學教研室，廣東 汕頭 515041）

激光顯微切割技術能夠切割特定的靶細胞并進行核酸、蛋白分析.目前，激光顯微切割技術可以切割至少200個細胞，并提取總RNA后，運用定量PCR技術分析基因的轉錄本[1].然而，切割少量細胞進行基因轉錄本的分析尚未見報道，本研究方案運用激光顯微切割技術切割20個大鼠海馬神經元細胞，在不提取RNA的情況下，進行NGF基因轉錄本的定量檢測.

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，顯微切割專用載玻片，0.5ml PCR管（EPPENDORF），無RNA酶的吸頭、八連管（Xygene），DNase I（Invitrogen）,NP-40(上海生工),小鼠抗NeuN（Millipore），驢抗小鼠IgG偶聯 NL577熒光基團(R&D)，定量PCR檢測試劑盒（Takara），引物（上海生工）、7300定量PCR儀（ABI），反轉錄試劑盒（Toyobo），全自動激光切割系統（Leica）.所有的PBS均用DEPC水處理.

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光

出生后2-3個月大鼠被斷頸處死，去除海馬組織，在液氮中速凍后進行冷凍切片，切片厚度為5μm，95%的乙醇固定5分鐘后，用含2M NaCl的PBS洗滌，小鼠抗NeuN的抗體室溫撫育5分鐘，洗滌后再用驢抗小鼠IgG偶聯NL577熒光基團室溫撫育5分鐘，用含2M NaCl的PBS洗滌后，95%乙醇、100%乙醇、二甲苯依次處理1分鐘，進行顯微切割.

1.2.2 細胞裂解

提前滴加含3%NP-40的DNaseI buffer 10μl在0.5mlPCR管蓋上，切割的細胞收集在管蓋中，置于42°C撫育20分鐘，管子倒置.

1.2.3 DNase I處理RNA后進行反轉錄

添加 2ul DNase I buffer、2ul DNase I、6ul無核酸酶水至上述離心管中，室溫放置15分鐘后進行反轉錄.反轉錄體系如下：4μl 10x RT buffer,4μl 25mM MgCl2,2μl 0.1M DTT,1μl 40U/μl RNaseOUT,1μl 200U/μl SuperScipt III RT.管子倒置，室溫10分鐘，再置于50℃的水浴鍋中50分鐘后，置于85℃ 5分鐘，1μl RNase H添加至反應體系中，37℃ 20分鐘后，進行定量PCR檢測.

1.2.4 定量PCR檢測

50μl的反應體系由 25μl Sybr Premix Ex Taq,1μl ROX reference dye,0.125μl 40pmol/μl上游引物,0.125μl 40 pmol/μl下游,2μl cDNA模板和21.75μl無核酸酶的水.反應體系按照95℃，5秒；60℃退火31秒,40個循環.

2 結果

免疫熒光檢測神經元NeuN，特異切割20個大鼠海馬神經元細胞，如下圖1：

圖1

PCR檢測切割細胞中的NGF轉錄本，GAPDH作為內參，結果如下圖2：

圖2 定量PCR檢測NGF和GAPDH轉錄本

由圖2可知，NGF的擴增曲線（A）和融解曲線（B）是特異性的，作為內參，GAPDH的擴增曲線（C）和融解曲線（D）也是特異的.因此，在切割的20個細胞中，我們可以對NGF的轉錄本進行定量PCR檢測.

3 討論

神經因子（NGF,Nerve growth factor）簡單來說，是一種蛋白質.在很多動物中可以得到.神經因子可以調節周圍和中樞神經元的生長發育，維持神經元的存活.神經生長因子（NGF）是神經營養因子中最早被發現，目前研究最為透徹的，具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用.NGF包含α、β、γ三個亞單位，活性區是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成的二聚體，與人體NGF的結構具有高度的同源性，生物效應也無明顯的種間特異性[2].

當神經受損傷后NGF的表達增加.有利于受損神經元恢復.實驗證明NGF mRNA在切割小鼠跖肌后2-4h內開始增長，切割后NGF免疫反應性結構形成，大多與切割的部位相鄰.此外，NGF可影響多種因子在背根神經節的表達[3].有實驗研究了TrkB缺失對于NGF及其受體的影響發現TrkB缺失的小鼠NGF和TrkA表達水平降低降低的TrkB有益于神經損傷處的神經移植，TrkB缺失導致損傷處肥大細胞的聚集[4].

通過激光顯微切割技術結合免疫熒光，特異切割大鼠海馬神經元細胞，定量PCR檢測NGF的變化，可將大鼠海馬病變造成的神經生物學病變與NGF的變化聯系起來，為進一步針對NGF的臨床治療提供參考依據.

〔1〕Porombka D,Baumg artner W,and Herden C.USA:J Virol Methods.2008,148(3):58–65.

〔2〕于一凡,譚曉琳.神經生長因子與周圍神經病變相關性研究進展 [J].中國現代醫藥雜志，2009(1l):128-130.

〔3〕Wu C，Boustany L,I.iang H，et a1.Nerve growth factor expression after plantar incision in the rat[J].USA:Anesthesiology,2007，107(1):128-135.

〔4〕Kotulska K，Magdalena LB，Wieslaw M，et a1.The influence of trkB deficiency on long-term outcome of peripheral nerve injury in mice.England:Folia Neuropathol，2007,45(2):82-92.