清酒乳桿菌素LSJ618的抑菌方式

柯芳芳，李 蕾

（安徽農業大學 生命科學學院，安徽 合肥 230036）

乳酸菌細菌素不僅種類多、來源廣而且生物學特性優良，是目前研究得最深入廣泛的細菌素，而這其中乳酸鏈球菌產生的Nisin是最早深入研究的代表，并依此建立多個研究模型，對其他細菌素的研究也有很大幫助，Nisin已被公認為安全高效的食品防腐劑[1].其他類乳酸菌素的研究也有很多，僅報道的清酒乳桿菌素Sakacin有30多種[2]，這些細菌素作為防腐劑均具有高安全性，無毒副作用等特點.目前，研究發現細菌素的生物活性的表現有多種作用機制，一般來說，細菌素在易感細菌細胞膜上形成孔道是最常見的作用機制，目前孔道形成的模型有桶板模型、地毯模型（The Carpet Model）以及環形孔模型（The Toroidal Model）三種[3]，準確了解這些作用機制對研究細菌素的毒性和合理應用細菌素具有重要意義.由于Nisin僅能抑制革蘭氏陽性細菌而對革蘭氏陰性細菌無抑制作用，故而迫切需要尋找新的高效廣譜細菌素，Sakacin LSJ618可對革蘭氏陽性細菌及陰性細菌都有一定的抑制作用，研究其作用方式有助于更好地將Sakacin LSJ618，甚至其它新型細菌素應用于食品行業.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及培養基

清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）LSJ618，本實驗室分離得到，MRS培養基培養；雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）（實驗室保存菌株），藤黃微球菌（Micrococcus luteus）（實驗室保存菌株），LB培養基培養.

1.1.2 主要試劑及儀器

SephadexTM G-50，紫外分光光度計，電導儀，AvantiTMJ-20XP高速冷凍離心機.

1.2 實驗方法

1.2.1 清酒乳桿菌素LSJ618的提純制備

清酒乳桿菌37℃恒溫靜置培養24h后，4℃，8000rpm，離心20min，取上清液并經0.22μm濾膜過濾；用截留分子量500Da的透析袋過夜透析除鹽，之后將透析袋置于PEG6000中包埋20min以濃縮樣品體積至上清液原體積.樣品最后經Sephadex G-50凝膠層析分離，收集活性組分，凍干備用.

1.2.2 清酒乳桿菌素LSJ618的效價及蛋白濃度的測定

采用二倍稀釋法分別測定清酒乳桿菌素LSJ618對藤黃微球菌及雞白痢沙門氏菌的抑菌效價（AU/mL），同時經Lowry法[4]測定了相應的蛋白濃度（mg/mL），計算其比活（AU/mg）.

1.2.3 清酒乳桿菌素LSJ618的抑菌率測定

接種藤黃微球菌以及雞白痢沙門氏菌于液體LB培養基中，30℃搖床培養12h后，8000rpm離心20min，收集菌體，再以新鮮LB培養基將其稀釋至約105cfu/mL，取10ml該菌懸液，加入LSJ618，使其終濃度為 40AU/mL，30℃孵育 0、10、30、60、90和120min后稀釋涂平板，以不添加細菌素的菌懸液作為對照，30℃倒置培養18-24h后計數并根據計算抑菌率[5].

1.2.4 葡萄糖能量化對清酒乳桿菌素LSJ618的抑菌能力的影響

將菌藤黃微球菌培養至對數生長期，經8000rpm離心20min，收集菌體，用5mmol/L pH6.0磷酸緩沖液（PBS緩沖液）洗滌菌體表面3次，并重懸于少量該緩沖液中，4℃靜置2h，使細胞代謝消化掉殘留能量，然后再次離心，收集菌體并重懸于上述緩沖液中，調節菌液濃度至108cfu/mL，向4支滅菌試管中分別加入5mL菌懸液，并向其中三支加入葡萄糖使其終濃度為0、100和200mmol/L，再分別加入LSJ618使終濃度為20AU/mL，設空白對照.在30℃下孵育30min，然后采用稀釋涂平板方法進行活菌計數.以同樣方法測定葡萄糖能量化對LSJ618抑制雞白痢沙門氏菌的影響，實驗平行3次.

1.2.5 清酒乳桿菌素LSJ618對敏感菌生長曲線的影響

取裝有200mL LB液體培養基的三角瓶四個（每種指示菌四個），均以4%（v/v）的接種量接入種子液（培養至對數期），30℃，110rpm恒溫搖床培養.實驗組1在接入種子液時同時加入LSJ618，并使其終濃度為20AU/mL；實驗組2和實驗組3均在在菌液培養6h后加入20AU/mL的細菌素LSJ618，其中第三組在繼續培養4h后，再次加入20AU/mL的LSJ618；對照組不添加LSJ618.每隔2h取出5mL培養液測OD600值，用LB液體培養基做空白對照調零.以培養時間（h）為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制藤黃微球菌和雞白痢沙門氏菌的特性生長曲線.實驗平行3次.

1.2.6 清酒乳桿菌素LSJ618對敏感菌菌液電導率的影響

分別將培養至到生長對數期的藤黃微球菌和雞白痢沙門氏菌的菌懸液經8000rpm，離心20min，收集菌體，用5mmol/L pH6.0 PBS緩沖液洗滌菌體表面3次，并重懸于該緩沖液中，調節菌液濃度至108cfu/mL.取4個滅菌三角瓶，分別加入40mL藤黃微球菌菌液，分為4組，第1、2組加入LSJ618其終濃度分別為20AU/mL和40AU/mL；第3組加入最終含量為5%（g/L）的乳酸鏈球菌nisin；對照組不添加任何細菌素.在混合后的 0min、5min、15min、30min、60min、90min和180min時分別從每組移取5mL菌液測定電導率.以同樣方法測定細菌素對雞白痢沙門氏菌菌液電導率的影響.實驗平行3次.

1.2.7 清酒乳桿菌素LSJ618對敏感菌紫外吸收物質泄露的影響

實驗前期步驟同1.2.6，添加細菌素后（對照組不添加），30℃恒溫孵育，在100min內，每隔20min取樣一次，每次取樣5mL，于8000rpm離心20min，收集上清液，然后用0.22μm的硝酸纖維素膜過濾，測定濾液在260nm和280nm處的OD值，以處理0min的樣品作為空白調零，記錄OD變化值.細胞上清液的吸光值的變化，即表示紫外吸收物質的含量的變化.以同樣方法測定細菌素對雞白痢沙門氏菌紫外吸收物質外泄的影響.實驗平行3次.

2 結果與分析

2.1 清酒乳桿菌素LSJ618的效價及蛋白濃度的測定結果

經Sephadex G-50凝膠層析獲的的活性樣品的效價為320AU/mL，蛋白濃度約為1.53mg/mL，比活為209.15AU/mg.

2.2 清酒乳桿菌素LSJ618的抑菌率的測定結果

圖1 清酒乳桿菌素LSJ618的抑菌率

圖1顯示了清酒乳桿菌素LSJ618經不同時間作用后對藤黃微球菌和雞白痢沙門氏菌的抑制效果.結果顯示，LSJ618對兩種菌均有較好的抑制作用，且在120min內隨著作用時間的延長，抑菌率呈現增長趨勢.處理30min的雞白痢沙門氏菌的抑菌率高達90%，而此時對藤黃微球菌的抑菌率僅50%，隨著處理時間的增加，LSJ618對兩種菌的抑菌率均可達到90%.說明LSJ618同時抑制革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，且可在更短時間內發揮對革蘭氏陰性細菌（雞白痢沙門氏菌）的抑制作用.

2.3 葡萄糖能量化對清酒乳桿菌素LSJ618的抑菌能力的影響

圖2及圖3顯示了葡萄糖能量化的不同細菌敏感性變化不同，從圖2可以看出，能量化的藤黃微球菌對LSJ618敏感性增加，也就是說LSJ618抑制能量化的藤黃微球菌的效果增強，雖然加入100mmol/L和200mmol/L的葡萄糖差異性并不明顯，這與McAuliffe等[6]發現lacticin 3147對能量化的敏感菌作用效果更好相一致.但是葡萄糖能量化的雞白痢沙門氏菌和沒有能量化的雞白痢沙門氏菌的敏感性并無區別，可能是由于細菌素作用于革蘭氏陰性菌的作用機制與作用于革蘭氏陽性菌的機制有一定區別，這個區別是什么仍有待進一步探索.

圖2 能量化的藤黃微球菌的敏感性變化（左）

圖3 能量化的雞白痢沙門氏菌的敏感性變化（右）

2.4 清酒乳桿菌素LSJ618對敏感菌生長曲線的影響

圖4 清酒乳桿菌素對藤黃微球菌生長的影響

圖5 清酒乳桿菌素對雞白痢沙門氏菌生長的影響

圖4-5顯示了LSJ618對藤黃微球菌及雞白痢沙門氏菌生長曲線的影響.結合兩圖可看出LSJ618對這兩種菌均可抑制其生長，與上文抑菌率實驗的結果（圖1）吻合，并且對這兩種敏感菌的影響的大致趨勢相同.在0時刻添加LSJ618可在至少12h內抑制或延緩細菌素進入生長對數期并可維持在極低菌濃度水平；當細菌已經培養進入長對數期后加入細菌素，可立即抑制細菌進一步繁殖，并在一定范圍內降低菌液濃度，20AU/mL的LSJ618可使菌液濃度降低約0.1個OD600值，這種抑制水平僅可維持8h或更短時間，之后細菌將再次大量繁殖，不過繁殖速率明顯低于對照組；多次加入細菌素可呈現出梯段式抑菌效果，因而我們可以推測，在一定范圍內加大清酒乳桿菌細菌素濃度可以增強其抑菌效果，這與李麗等[6]研究乳酸片球菌素作用機理時觀察到的現象基本一致.

2.5 清酒乳桿菌素LSJ618對敏感菌細胞膜透性的影響

菌體胞內帶電粒子的流出及核酸蛋白類物質的外泄均可表示細菌細胞膜受到損傷[7]，為了探討LSJ618對藤黃微球菌及雞白痢沙門氏菌細胞膜透性的影響，我們研究了不同濃度細菌素處理后的兩種敏感菌的菌液電導率值變化及其紫外物質吸收值的變化，并以5%的Nisin作為參比對象.

圖6 細菌素對藤黃微球菌菌液電導率的影響

圖7 細菌素對雞白痢沙門氏菌菌液電導率的影響

圖8 細菌素對藤黃微球菌菌液紫外吸收物質泄露的影響

圖9 細菌素對雞白痢沙門氏菌菌液紫外吸收物質泄露的影響

圖6-7顯示了20AU/mL、40AU/mL的 LSJ618及5%的nisin處理的藤黃微球菌及雞白痢沙門氏菌菌液電導率值的變化，圖8-9顯示了紫外吸收物質泄露值的變化，這些都可反應細菌素對指示菌細胞膜透性的影響.

以藤黃微球菌作為指示菌時，未作處理的對照組的電導率不隨時間發生變化，添加了LSJ618和Nisin的菌液電導率值和紫外吸收物質變化值均隨時間延長而增大，且增大的趨勢先急后緩；以雞白痢沙門氏菌作為指示菌時，添加Nisin的菌液電導率值及紫外吸收物質變化值并不隨時間延長而發生變化，這與Nisin不抑制革蘭氏陰性菌的現象一致，但是清酒乳桿菌素LSJ618可同時引起兩種指示菌電導率值及紫外吸收物質變化值的升高，可以推斷LSJ618可增加這兩種指示菌細胞膜透性，進而殺死細菌，這與前文所述結果一致.

添加40AU/mL的LSJ618比添加20AU/mL的LSJ618可引起指示菌菌液電導率及紫外吸收物質變化值加大，即增加LSJ618濃度可以增大其抑菌效果，這一結論驗證了與LSJ618對敏感菌生長曲線的影響試驗中結果相一致.

3 結論與討論

清酒乳桿菌素Sakasin LSJ618可在較短時間內發揮對藤黃微球菌（革蘭氏陽性菌）和雞白痢沙門氏菌（革蘭氏陰性菌）的抑制作用，40AU/mL的Sakasin LSJ618處理1h可達近90%的抑菌率.研究Sakasin LSJ618對這兩種菌的生長曲線的影響，發現在初始時刻添加Sakasin LSJ618可有效保持菌液濃度維持在一個很低水平長達12h，當指示菌進入生長對數期后，添加Sakasin LSJ618可立即使菌液OD600值下降并維持數小時，但幅度不是很大，多次添加Sakasin LSJ618會使指示菌生長曲線多次出現下降現象，表明增加Sakasin LSJ618濃度有助于其抑菌效果更加明顯.此外經Sakasin LSJ618處理后的只是菌菌液電導率值及紫外吸收物質變化值都有一定增加，表明細菌細胞膜受到損傷，這可能就是Sakasin LSJ618的抑菌作用發揮的第一步，這與很多其他細菌素的作用機理相似，但是能量化的藤黃微球菌對Sakasin LSJ618更加敏感，而雞白痢沙門氏菌并無此現象，說明Sakasin LSJ618對革蘭氏洋相細菌和革蘭氏陰性細菌的作用機制有一定區別，有待進一步的研究.

〔1〕O'sullivan L,Ross R,Hill C.Potential of bacteriocin-producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality[J].Biochimie,2002,84(5-6):593-604.

〔2〕姜潔,施波,方佳琪,等.清酒乳桿菌細菌素研究的現狀及展望 [J].中國微生態學雜志,2011,23(3):268-271.

〔3〕Okorochenkov S A, Zheltukhina G A,Nebol'sin V E.Antimicrobial Peptides:the mode of action and perspectives of practical application. Biomedical Chemistry,2011,5(2):95-102.

〔4〕汪家政,范明.蛋白質技術手冊[M].北京:科學出版社,2001.51-54.

〔5〕錢麗紅,陶妍,謝晶.茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理 [J].微生物學通報,2010,37(11):1628-1633.

〔6〕McAuliffe O,Ryan MP,Ross RP,et al.Lacticin 3147, a broadspectrum bacteriocin which selectively dissipates the membrane potential[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(2):439-445.

〔7〕李麗,韓燁,周志江.乳酸片球菌素的抑菌方式[J].食品研究與開發,2009,30(5):181-185.

〔8〕Cherif A,Rezgui W,Raddadi N,et al.Characterization and partial purification of entomocin 110,a newly identified bacteriocin from Bacillus thuringiensis subsp. Entomocidus HD110[J].Microbiological Research,2008,163(6):684-692.