RNAi沉默Notch1基因對人骨肉瘤細胞MG63的促凋亡作用

吳德明，楊志強，劉 翔，江 川，戴 閩

(南昌大學第一附屬醫院，南昌330006)

骨肉瘤是是兒童和青少年最常見的骨原發性惡性腫瘤，致殘率及病死率均高。盡管近年來骨肉瘤的診斷、治療水平有了很大的提高，但骨肉瘤保肢治療效果遠未達到令人滿意的程度。Notch信號通路是介導細胞與細胞之間直接接觸的主要信號通路之一，調控多細胞機體的細胞增殖、分化和凋亡［1～3］。人類許多腫瘤中均可檢測到Notch信號通路活性的改變，由于腫瘤來源及其微環境的不同，Notch信號通路具有促進或抑制腫瘤發生、發展的雙重作用［4，5］。近年來，特異性阻斷 Notch信號通路從而起到抗腫瘤作用，已作為腫瘤治療的新途徑受到了廣泛關注［6，7］。Notch1 基因是 Notch 信號通路中的重要組成部分，沉默其表達將明顯抑制Notch信號通路的功能［8，9］。2011年3月 ～2012年 5月，本實驗通過觀察沉默Notch1基因對人骨肉瘤細胞MG63增殖和凋亡的影響，探討其可能的作用機制，為今后通過抑制Notch信號通路治療骨肉瘤提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人骨肉瘤細胞系MG63由武漢大學中國典型生物保藏中心提供，培養于含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中，37℃、5%CO2培養箱內常規傳代培養。

1.1.2 試劑 mNotch-1短發夾狀 RNA(mNotch-1 shRNA)片段的設計及合成:根據人Notch1基因的cDNA 序列(Genbank:NM_017617.3)，利用 Ambion公司在線設計軟件，設計出人Notch1基因RNA干擾(RNAi)片段(大連寶生物有限公司)。AnnexinVFITC試劑購自晶美生物工程有限公司，小牛血清、RPMI 1640培養基、噻唑藍(MTT)購自美國Hyclone公司。兔抗人Notch1抗體購自美國ABcom公司，兔抗人Bcl-2和Bax抗體以及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司，PVDF膜為Millipore公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖抑制實驗(MTT比色法) 將MG63細胞以1×104/mL接種于96孔培養板，加無血清培養基常規培養24 h，然后利用mNotch-1 shRNA處理細胞，利用MTT技術分析mNotch-1 shRNA轉染前及轉染24、48、72 h時MG63細胞的增殖情況。加入新配制的MTT，置37℃、5%CO2培養箱內培養4 h，棄培養液，加入二甲基亞砜(DMSO)，10 min后，利用酶標儀檢測490 nm吸光度(A)值。根據公式:細胞抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。以上實驗均重復3次。

1.2.2 流式細胞儀檢測 調整細胞密度為5×105個/mL，經 mNotch-1 shRNA 處理細胞 24、48、72 h，分別制成單細胞懸液，加AnnexinV-FITC室溫避光10 min，沖洗、離心、重懸細胞，加入 20 μg/mL PI，4℃避光30 min后上機檢測。對照組為mNotch-1 shRNA處理后即刻上機檢測(0 h)。每組設3個樣本。分析軟件計算細胞凋亡率。

1.2.3 Western blot檢測相關目的蛋白表達 取經mNotch-1 shRNA 處理24、48、72 h后的細胞，調整密度為1×106/mL，用胰蛋白酶消化液消化后，1 000 r/min離心5 min收集細胞，棄上清，加入0.5 mL預冷蛋白裂解液，劇烈振蕩使細胞重懸。按比例加入1 mL蛋白抽提試劑，振蕩均勻，4℃靜置10 min。隨后12 000 r/min、4℃離心10 min，取中間相，最后用無水乙醇洗滌并沉淀蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白含量。取 100 μg總蛋白上樣于 10%SDSPAGE，電泳后轉PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加兔抗人 Notch1抗體(1∶500)、兔抗人 Bcl-2抗體(1∶800)和兔抗人Bax抗體(1∶800)4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(濃度1∶4 000)室溫孵育1 h，ECL發光劑發光，定影、顯影，膠片曝光。用同樣方法以β-actin作上樣對照。利用Quantity One軟件分析測定條帶相對A值，并計算 ABcl-2/Aβ-actin和 ABax/Aβ-actin值。

2.4 統計學方法數據以ˉx±s表示，用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析和Pearson相關分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNAi沉默Notch1基因對骨肉瘤細胞MG63增殖的影響 mNotch-1 shRNA處理細胞后，細胞生長受到不同程度抑制，抑制率與作用時間呈現明顯的依賴效應，相關分析顯示兩者呈正相關(r=0.994，P ＜0.01)。MTT 檢測發現，mNotch-1 shRNA處理細胞24 h后，MG63細胞的抑制率為20%，48 h達到半數有效抑制率，在處理72 h后細胞抑制率達到最高值85%，不同時間處理組與空白對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 流式細胞儀檢測結果 轉染mNotch-1 shRNA組MG63細胞的凋亡率隨著時間的延長而逐漸增加，在作用 24、48、72 h后，細胞凋亡率分別為19.4%、37.6%、51.6%，對照組細胞凋亡率為9.9%。實驗組細胞凋亡率較對照組均有明顯升高(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 Annexin V-FITC染色檢測結果

2.3 Western blot檢測結果 mNotch-1 shRNA處理后，隨著時間的延長，MG63細胞中Notch1基因表達明顯減少(P＜0.01)。另外阻斷Notch信號通路可以顯著抑制Bcl-2基因的表達并上調Bax基因的表達(P ＜0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測 Notch1、Bcl-2和Bax基因的蛋白表達水平

3 討論

Notch信號通路與腫瘤發生發展關系密切，最早發現Notch信號通路與腫瘤有關是在1991年發現Notch1在急性T淋巴細胞白血病中起作用，目前人們在許多腫瘤中發現有 Notch信號的異常［10］。盡管Notch信號在少數腫瘤中表現出腫瘤抑制作用，但是其信號傳導的活化與多種腫瘤的發生發展有關。治療與Notch相關的腫瘤，可以把Notch信號傳導通路作為選擇性殺死腫瘤細胞的活性靶點，通過阻斷Notch信號達到治療腫瘤的效果。本實驗利用mNotch-1 shRNA處理體外培養的MG63細胞后，MTT結果顯示處理組細胞增殖均受到不同程度的抑制，表明了在人骨肉瘤中阻斷Notch信號通路可以抑制骨肉瘤細胞增殖。

Kerr等于1972年首先提出細胞凋亡的概念。近年來隨著對凋亡分子機理的逐步認識，人們發現腫瘤發生是細胞增殖過度與凋亡減少導致過量蓄積的結果。Rieger等發現誘導腫瘤細胞凋亡是一條有效的腫瘤治療途徑。許多具有細胞毒性的抗腫瘤藥物都可以誘導凋亡，而且腫瘤發生過程中出現抑制凋亡的相關基因變異，會減弱腫瘤對藥物的敏感性。本研究結果顯示，mNotch-1 shRNA處理MG63細胞后，細胞凋亡增加，且隨著mNotch-1 shRNA處理的時間增加，細胞凋亡率隨之增加，與對照組比較，不同時間段均有統計學差異。結合MTT結果，進一步說明RNAi沉默Notch1基因能有效誘導人MG63細胞凋亡。這與 Fan 等［11］、Cuevas等［12］利用 γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號通路可誘導其他腫瘤細胞凋亡的研究結果相一致。

關于通過RNAi沉默Notch1基因促進腫瘤細胞凋亡的機制，目前尚不十分明確。在諸多與細胞凋亡相關的蛋白中，已證實Bcl-2家族基因(Bcl-2和Bax等)的活性與細胞的生存和凋亡密切相關。人Bcl-2是大小為26 kD的跨膜蛋白，通過與Bcl-2家族成員之間的相互作用調控細胞的生存與凋亡［13］。本實驗結果顯示，RNAi沉默Notch1基因可以有效降低MG63細胞Bcl-2蛋白的表達水平，并上調Bax蛋白的表達。而最近一項研究結果顯示，激活Notch信號通路可以抑制Bax誘導的細胞凋亡。這些結果說明RNAi沉默Notch1基因誘導MG63細胞凋亡的機制可能與調控Bcl-2家族基因的表達有關。

但由于Notch信號通路有時起抑癌作用，有時起原癌基因的作用，必須分清Notch信號通路在特定腫瘤中的作用機制。雖然有關Notch信號通路在腫瘤發病機制和腫瘤治療中的作用尚有許多問題需要回答，但隨著研究的深入，Notch信號通路作為新一類抗腫瘤治療靶點將具有廣闊的應用前景。

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