導尿管相關糞腸球菌生物被膜形成的分子機制探討

薛 婷，吳利先

(云南大理學院基礎醫學院微生物學教研室，云南大理671000)

腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，但近年研究已證實其為院內感染的重要致病菌［1］。20世紀80年代以來，腸球菌嚴重感染的發生率和病死率明顯升高，已成為傷口和尿路感染最常見的致病菌，導致菌血癥的第三大致病菌，其中糞腸球菌是與臨床感染相關的最常見腸球菌，還可引起腹腔感染、肺囊性纖維化、心內膜炎和腦膜炎等［2］，并且由于其固有耐藥和獲得性耐藥，使腸球菌感染的治療非常棘手［3］。腸球菌普遍具有形成生物被膜的能力，它可以阻礙或延遲細菌與抗生素接觸，則降低腸球菌對藥物的敏感性，致使感染難以治愈［4］。細菌生物被膜在細菌致病機制及耐藥性形成中均具有重要意義。因此，學者們開始關注腸球菌引起的感染，探討腸球菌生物被膜形成的分子機制。細菌生物被膜的形成是由某些獨特基因所控制的［5］，糞腸球菌生物被膜形成也是如此。我們用PCR技術對分離的糞球菌生物被膜菌組和浮游菌組細菌中的ebpA、gelE和fsrB三種與生物被膜形成相關的基因進行檢測，探討糞腸球菌生物被膜形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 無菌操作收集云南省大理學院附屬醫院泌尿外科2011年10月～2012年5月留置導尿管患者導尿管標本，按衛生部頒布《全國臨床檢驗操作規程》進行培養和生化反應。

1.2 主要試劑及儀器 BHI培養基由北京陸橋技術有限公司提供;PCR試劑，溶菌酶，細菌基因組DNA提取試劑盒以及Ladder Marker均由北京天根生化科技有限公司提供。全自動細菌鑒定及藥敏分析儀VITEK2為法國生物梅里埃公司產品，PCR擴增儀為PE公司產品，全自動凝膠圖像分析系統為Syngene公司產品。

1.3 細菌的分離培養與鑒定 將收集至醫院的導尿管標本，通過剛果紅培養基、生物被膜半定量檢測以及細菌生理生化反應，可疑菌株用全自動細菌鑒定儀鑒定，篩選生物被膜陽性糞腸球菌及其相應的浮游菌。

1.4 基因擴增 將鑒定過的細菌培養過夜，用DNA提取試劑盒提取DNA作為模板，根據Gene Bank中的序列設計引物。gelE-F:5'-AGT GAA CGC TAC AGA TGG AAC-3'，gelE-R:5'-CGT TCC GTG TAA AGC AAT TCC-3'，長度 145 bp;ebpA-F:5'-AAA AAT GAT TCG GCT CCA GAA-3'，ebpA-R:5'-TGC CAG ATT CGC TCT CAA AG-3'，長度 111 bp;fsrB-F:5'-TGG ATC AGG AAG ATC AAT CAG G-3'，fsrB-R:5'-GTA CGA CGT ATA CAA TAA AGG TTT CG-3'，長度147 bp。取1 μL DNA 為 PCR 模板，濃度為25 μmol/L的上述引物各1 μL為進行 PCR。反應條件為:95℃3 min后，按下列參數循環35次，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，最后72℃延伸5 min。凝膠成像儀拍照記錄結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.0軟件進行 χ2統計分析。以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 細菌的分離培養與鑒定 通過剛果紅培養基、生物被膜半定量檢測以及細菌生理生化鑒定得到糞腸球菌生物被膜菌21株及其相應的浮游菌21株。

2.2 gelE、ebpA和fsrB基因的PCR擴增結果 對上述21株生物被膜糞腸球菌及其相應的浮游菌行gelE、ebpA和fsrB基因的PCR擴增后，陽性菌株出現了相應的條帶，見圖1～3。

2.3 gelE、ebpA和fsrB基因的檢測結果分析 21株生物被膜糞腸球菌gelE、ebpA和fsrB基因的陽性率分別是 9.52%(2/21)、95.24%(20/21)和9.52%(2/21);其相應的21株浮游菌組糞腸球菌檢測出的陽性率分別是85.71%(18/21)、9.52%(2/21)和90.48%(19/21)，兩者比較(χ2值分別為 24.436、9.348、27.524，P 均 ＜0.05)。

3 討論

圖3 fsrB基因PCR檢測電泳圖

腸球菌已經成為醫院感染常見的條件病原菌，當人體免疫力低下或腸球菌定植部位改變時，可引起泌尿道感染、腹腔感染、傷口感染，甚至菌血癥及敗血癥、心內膜炎等。因此，對腸球菌致病性的研究引起了人們的高度重視。

細菌生物被膜的形成是由某些獨特基因所控制的［5］。gelE基因編碼的明膠酶，gelE的表達由 fsr編碼的密度感應系統調控，與糞腸球菌生物被膜的形成有關。fsr調節基因座由fsrA、fsrB和fsrC三個基因組成，編碼糞腸球菌fsr密度感應信號傳導系統，該系統可以通過影響明膠酶的生成影響生物膜的形成，fsr缺失突變株減少了聚苯乙烯平板上腸球菌生物膜形成［6，7］。菌毛形成是生物膜形成的必要條件，由多種類型的前體蛋白交聯構成。ebp基因座編碼菌毛，ebp操縱子包含ebpA、ebpB、ebpC和相關的srtC(編碼分選酶C)基因［8］。糞腸球菌菌毛缺失突變株減少了糞腸球菌菌毛操縱子ebpA、B、C的表達，減少了菌毛的產生，導致原發粘附的缺失，不能形成生物膜［9］。本實驗采用PCR技術檢測所篩選的21株糞腸球菌生物被膜菌及其浮游狀態菌的gelE、ebpA和fsrB基因，發現ebpA代表的菌毛操縱子在生物被膜陽性組中表達率高于浮游菌組，而gelE與fsrB基因的結果相反，生物被膜組中表達率均要低于浮游菌組，這與文獻相一致［10］。

因此，可推測ebpA基因能促進糞腸球菌生物被膜形成;gelE和fsrB基因可抑制生物被膜形成。這將為進一步研究腸球菌生物被膜形成的分子機制，深入確定可行的藥物靶點和小分子物質，以達到抑制生物被膜形成和抑制感染期病原體毒性，來解決實際臨床難題提供依據。

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［10］漆涌，鄒彬彬，伍勇.糞腸球菌 esp、gelE、ebpA 基因及 QS-fsr系統與生物被膜形成關系的研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2010，33(10):931-935.