宮頸鱗癌組織中WWOX與Bcl-xl基因的表達及其意義

楊秀蓮，王 筑，佟麗波

(1惠州市第三人民醫(yī)院，廣東 惠州 516002;2佳木斯大學第一附屬醫(yī)院)

正常細胞的正常更新要依賴細胞增殖與調(diào)亡的平衡來調(diào)節(jié)。腫瘤組織的生長失控不僅與細胞增殖旺盛有關，還與腫瘤細胞的凋亡受到抑制使其生存期延長有關。WWOX是最新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，有研究表明它是一種促凋亡蛋白，參與細胞凋亡通路的調(diào)節(jié)。Bcl-xl是Bcl-2基因家族的成員之一，主要參與線粒體介導的細胞凋亡的負相調(diào)控，可阻止各種應激所誘發(fā)的細胞凋亡過程。許多研究表明，WWOX、Bcl-xl在許多惡性腫瘤中表達異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。本研究采用免疫組織化學技術檢測WWOX與Bcl-xl蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集惠州市第三人民醫(yī)院及佳木斯大學第一附屬醫(yī)院病理科2008年9月～2012年6月存檔的石蠟包埋標本60例，其中宮頸鱗癌50例、宮頸上皮內(nèi)瘤變10例、正常宮頸組織標本10例。患者年齡28～70(48±9.44)歲。Ⅰ期32例，Ⅱa期18例;病理分化程度:高分化20例，中低分化30例;發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結轉(zhuǎn)移34例。其病程經(jīng)統(tǒng)計學檢驗差異無統(tǒng)計學意義。所有研究標本均再次做HE染色，由兩位病理醫(yī)師再次證實。

1.2 主要試劑 兔抗人WWOX單克隆抗體、兔抗人Bcl-xl單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋公司。

1.3 實驗方法 常規(guī)切片，HE染色，采用中杉公司推薦的SP免疫組化染色法，檢測細胞中WWOX及Bcl-xl蛋白的表達情況。WWOX抗體用PBS 1∶100稀釋為工作液，Bcl-xl抗體用PBS 1∶150稀釋為工作液，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知卵巢癌陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判定 光鏡下觀察，WWOX和Bcl-xl抗原陽性反應均為位于細胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色均勻細顆粒。參照綜合染色強度和陽性細胞數(shù)(占總細胞數(shù)的百分比)進行半定量處理。染色強度按下列標準評分:細胞無顯色者為0分，呈淺黃色者為1分，呈棕黃色者為2分，呈棕褐色者為3分;陽性細胞數(shù)評分方法:陽性細胞占總細胞數(shù)10% ～50%者為2分，51% ～80%者為3分，＞80%者為4分。上述兩項評分相加小于3分為陰性;3分為+;4～5分為++;6～7分為+++。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SAS9.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗及Fishers確切概率法檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 WWOX與Bcl-xl基因在不同宮頸組織表達比較 WWOX蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌陽性表達率分別為90.00%(9/10)、75.00%(15/20)、34.00%(17/50);Bcl-xl蛋白陽性表達率分別為 10.00%(1/10)、30.00%(6/20)、66.00%(33/50)。WWOX、Bcl-xl在宮頸鱗癌中陽性表達率與正常宮頸及宮頸上皮內(nèi)瘤變相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 WWOX與Bcl-xl基因在宮頸鱗癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關系 見表1。

表1 WWOX及Bcl-xl基因在宮頸鱗癌中表達與臨床病理參數(shù)的關系

2.3 相關性分析 在50例宮頸鱗癌中，WWOX與Bcl-xl表達共陽性、共陰性均為10例，二者單獨陽性分別為7例和23例，經(jīng)Spearman等級相關分析，表明WWOX與Bcl-xl在宮頸鱗癌中的表達呈負相關(r= －0.164，P ＜0.05)。

3 討論

目前研究認為惡性腫瘤是一種多基因性疾病，原癌基因激活、抑癌基因功能喪失及某些修飾基因功能的改變導致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。具體來講，腫瘤的發(fā)生與致癌因子誘導染色體的常見脆性位點，進而引起相關抑癌基因的失活有著較為密切的關系。WWOX基因［1］作為一個位于普通型脆性位點基因，它在射線、病毒、某些毒素的作用下均可能發(fā)生基因片段的變異或缺失，如果所變異或缺失的部分恰好是能夠抑制細胞異常生長增殖的基因，則這種變異和缺失可能抑制細胞凋亡、促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，WWOX蛋白能夠與相關蛋白如p53、p73、ErbB4、c-jun、Ap-2 等結合，阻止后者進入細胞核，從而抑制相關蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)錄和表達［2］。而這些相關蛋白均處于信號轉(zhuǎn)導途徑的關鍵點，說明WWOX在抑制蛋白轉(zhuǎn)錄、細胞生長和誘導凋亡等信號轉(zhuǎn)導途徑中均有重要作用。多項研究［3～6］表明，WWOX蛋白表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，特別與上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌中WWOX陽性表達率均低于正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，推測WWOX的表達下降可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生。本研究結果顯示，WWOX陽性表達率隨著臨床分期增加，組織學分級增高逐漸下降;且在16例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中，WWOX表達缺失。提示W(wǎng)WOX在宮頸鱗癌中表達下降或缺失，可能是導致腫瘤細胞生長、擴散和轉(zhuǎn)移的一個重要潛在因素，可能成為宮頸鱗癌早期診斷及判斷預后的一個重要指標。

Bcl-xl屬Bcl-2基因家族成員之一，是一種凋亡抑制因子［7］。研究表明，Bcl-xl在許多腫瘤組織中表達升高，它能夠抑制抗腫瘤制劑誘導的細胞凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展;而用反義寡核苷酸抑制Bclxl的表達將促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡［8］。本研究表明，在宮頸鱗癌組織Bcl-xl蛋白陽性表達率均高于正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織;且Bcl-xl陽性表達率隨著臨床分期增加、組織學分級增高及淋巴轉(zhuǎn)移逐漸升高，這說明Bcl-xl表達增高可能促進了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

有文獻報道，WWOX通過下調(diào)凋亡抑制因子Bc1-xl和Bc1-2及上調(diào)p53的表達而增強TNF的細胞毒性功能，而TNF通過促使線粒體通透性的改變而導致WWOX從線粒體釋放入核內(nèi)，起到了促凋亡的作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，在同一宮頸鱗癌組織中，WWOX陽性表達下調(diào)，而Bcl-xl蛋白陽性表達上調(diào)，二者呈明顯的負相關。因此推測，它們在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的過程中可能共同存在、共同發(fā)揮作用，兩者可能通過上述機制導致腫瘤細胞的凋亡受到抑制，從而促進宮頸鱗癌的發(fā)生及進展，有望作為檢測宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展及判斷預后的又一腫瘤生物學指標。

［1］Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F，et al.The tumor suppressor gene WWOX at FRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis［J］.Clin Cancer Res，2004，10(7):2459-2465.

［2］Chang NS，Hsu LJ，Lin YS，et al.WW domain-containing oxidoreductase:a candidate tumor suppressor［J］.Trends Mol Med，2007，13(1):12-22.

［3］熊宙芳，王澤華.卵巢上皮性癌組織中WWOX與Bcl-xl基因的表達及其意義［J］.華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2010，39(3):362-365.

［4］胡慧敏，張廣美.FHIT、WWOX蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達及臨床意義［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2010，31(l7):2693-2694.

［5］宋偉，姜蕊，于世英.非小細胞肺癌組織中WWOX蛋白表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(18):10-11.

［6］楊文峰，孫志熙，孔垂?jié)桑?膀胱移行細胞癌中WWOX蛋白的表達及臨床意義［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(41):31-32.

［7］Lebedeva I，Rando R，Ojwang J，et al.Bcl-xL in prostate cancer cells:effects of overexpression and down-regulation on chemosensitivity［J］.Cancer Res，2000，60(21):6052-6060.

［8］Takehara T，Takahashi H.Suppression of Bcl-xL deamidation in human hepatocellular carcinomas［J］.Cancer Res，2003，63(12):3054-3057.

［9］Chang NS，Pratt N，Heath J，et al.Hyaluronidase induction of a WW domain-containing oxidoreductase that enhances tumor necrosis factor cytotoxicity［J］.J Biol Chem，2001，276(5):3361-3370.