內質網應激相關的凋亡在糖尿病大鼠腎臟組織中的作用

陳玉鳳，郭獻山，耿秀琴，張會娟

(1新鄉市中心醫院，河南新鄉453003;2鄭州大學第一附屬醫院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的慢性并發癥之一，是引起終末期腎功能衰竭的病因之一，嚴重影響著糖尿病患者生活質量［1］。已有報道，糖尿病模型腎組織中細胞凋亡數較非糖尿病腎臟明顯增多，并伴有凋亡相關基因的改變［2］。內質網應激(ERS)是新發現的一種獨立于以往經典的細胞膜受體或線粒體途徑的第 3條凋亡信號途徑［3］，以GRP78、Caspase12等作為ERS及相關細胞凋亡的標志性蛋白。2010年4～11月，本研究通過應用鏈脲佐菌素(STZ)誘導大鼠建立糖尿病模型［4］，觀察在不同病程階段，腎臟組織中的GRP78、Caspase12表達變化情況，探討ERS在DN中的作用及意義，為DN的發病機制及治療研究提供可能依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 血糖由德國艾柯夫公司Biosen血糖測量儀檢測，24 h尿蛋白排泄量(采用考馬斯亮藍法，考馬斯亮藍G250，上海超研生物科技有限公司)、血肌酐在鄭州大學第一附屬醫院化驗室檢測。STZ(規格100 mg/支)，由美國Sigma公司提供，兔抗鼠GRP78多克隆抗體(編號為bs-1219P)、兔抗鼠Caspase12多克隆抗體(編號為bs-1105R)購自北京博奧森生物有限公司。SP試劑盒、DAB顯色劑購自北京中山生物技術公司，TRIzol reagent、RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，RT-PCR引物合成于北京賽百盛生物技術有限公司。

1.2 模型的建立及分組 32只清潔級健康雄性SD大鼠，8周齡，體質量180～220 g，由河南省實驗動物中心提供。適應性喂養14 d，禁食水12 h，隨機抽取 22 只，用溶于 0.1 mol/L、pH 4.0 檸檬酸/檸檬酸鈉溶液稀釋成1%的STZ溶液，按60 mg/kg一次性腹腔注射建立DM模型，72 h后尾部取血，以血糖＞16.7 mmol/L以上，定為糖尿病模型，未達標準者予以剔除(n=2)，20只大鼠按飼養時間分為DM 6周、DM 12周組，余10只試驗大鼠為對照組，用適量檸檬酸/檸檬酸鈉溶液腹腔注射，實驗過程中不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3 實驗方法 所有大鼠于河南省實驗動物中心飼養室分籠飼養，每籠1只，以標準大鼠飼料(購自河南省實驗動物中心)喂養，自由飲水。飼養室內保持良好通風，室溫18～22℃、相對濕度45% ～65%。各組大鼠在相應時段分批用代謝籠收集24 h尿液，測定24 h尿白蛋白排泄量;禁食12 h后用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于腹主動脈采血，分離血清，測血糖、血肌酐水平。同時取出右側腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，留取一部分腎臟置于4%的甲醛固定液中，以待免疫組化檢查，剩余部分置于液氮中，再轉入－80℃冰箱保存以備提取RNA。

1.4 組織病理及免疫組織化學染色 腎臟組織用4%的甲醛溶液浸泡24 h，然后石蠟包埋后切成4 μm厚的薄片用來做HE染色和免疫組化。GRP78和Caspase12的檢測用SP法，按說明書步驟操作:脫蠟、漂洗、抗原修復、消除內源性活氧化物酶，滴加封閉液，棄封閉液分別加抗 GRP78抗體和抗Caspase12抗體(羊抗大鼠多克隆抗體)，再加生物素標記的第二抗體與鏈親和素—過氧化物酶溶液漂洗，DAB液染色，蘇木素復染，用已知陽性結果作為陽性對照，用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，應用BioSens digital imaging圖象分析軟件進行分析，每張標本隨機選取5個視野，計算平均光密度值來進行統計分析。

1.5 細胞凋亡檢測 用原位末端標記凋亡細胞(TUNEL法)檢測，按照原位凋亡試劑盒(TACSTMTDT Kit)進行操作。光鏡下正常細胞核呈藍色，凋亡陽性細胞核呈棕黃色。細胞凋亡指數(AI)的計算:每張陽性切片選取5個陽性細胞最多的高倍視野(400×)，計算500個腎臟細胞中陽性細胞所占的百分比。腎臟AI=500個腎臟細胞中陽性細胞數/500個腎臟細胞細胞總數。

1.6 半定量RT-PCR法 取腎臟組織100 mg加入1 mL Trizol充分均漿及彈打均勻提取總RNA。于紫外分光光度計上測定260 nm和280 nm波長處OD值，OD260/OD280在1.6 ～2.0 為所需 RNA 純度，計算其含量。逆轉錄為cDNA，以此為模板進行PCR擴增，GRP78引物序列為:5'-GACCATGGAGAAAGCTGTAGAGA-3'，5'-CCAAGACACGTGAGCAACTGCTA-3'擴增長度為373 bp;Caspase-12引物序列為:5'-TGGAGGTAAATGTTGGAGTG-3'，5'-GCTTGTGGATACCCAAATAG-3'，擴增長度為584 bp;內參 β-actin的引物序列為:5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，擴增長度為207 bp。擴增條件如下:94℃預變性2 min，1個循環;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環;72℃總延伸6 min。分別取PCR產物與緩沖液混合，經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，目的基因mRNA的表達量以目的基因DNA條帶和β-actin的 DNA條帶灰度值比值計算。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以ˉx±s表示，數據統計采用方差分析及獨立樣本的t檢驗，相關性分析采用直線相關分析。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況 實驗過程中，對照組大鼠精神狀態良好，反應敏捷，體質量增加明顯，毛色白而光澤。DM組大鼠出現被毛無光澤、飲水量偏多、尿量多、多食、體質量偏輕，并隨著時間的延長，上述癥狀、體征加重，其中2只出現采血處潰爛(經局部消毒后好轉)。

2.2 生化指標比較 與對照組比較，DM模型組血糖、血肌酐、24 h尿蛋白排泄量均高于對照組(P＜0.05);與DM 6周組比較，DM 12周組血肌酐、24 h尿蛋白排泄量均增高(P＜0.05)，而血糖在兩組之間無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖、尿蛋白排泄量、血肌酐的比較(ˉx±s)

2.3 腎臟組織病理學改變 HE染色顯示發現，對照組大鼠腎組織結構完整，分層清晰，細胞形態比較完好;DM 12周組大鼠腎臟橫切面可見腎小球體積增大，基底膜增厚，系膜基質增多，分層紊亂，腎小管上皮細胞小灶樣萎縮，小動脈管壁增厚等，DM 6周組大鼠上述病理改變較輕。

2.4 原位細胞凋亡及免疫組化檢測 TUNEL陽性染色信號定位于腎臟細胞核內，呈棕黃色，體積等于或小于正常細胞核;正常細胞核呈淡藍色。正常大鼠腎臟偶見細胞凋亡，DM 6周、DM 12周組大鼠凋亡細胞逐漸增多，在腎小球和腎小管中均可觀察到。DM 6周組腎臟細胞的AI高于對照組(P＜0.05)，DM 12周組腎臟細胞的AI高于DM 6周組(P＜0.05)。免疫組化檢測腎臟組織中存在 GRP78、Caspase12蛋白，陽性表達部位染色呈棕黃色，兩者的表達部位基本一致，主要位于腎小球、腎小管和間質部位。對照組有少量表達，DM 6周組表達升高，DM 12周組升高更明顯(P＜0.05)。見表2。

表2 腎臟細胞AI與GRP78及Caspase12的表達(ˉx±s)

2.5 RT-PCR結果 DM 各組 GRP78、Caspase12 mRNA的表達較正常對照組增加(P＜0.05)，DM 12周組高于DM 6周組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織GRP78和Caspase12 mRNA相對表達量(ˉx ±s)

2.6 相關性分析 GRP78蛋白表達與24 h尿蛋白排泄量、血肌酐、Caspase12的蛋白表達、腎臟AI正相關(r=0.896、0.937、0.841、0.896，P=0.043、0.015、0.015、0.038).

3 討論

DN的發病機制尚不完全明確。文獻研究表明，細胞凋亡作為一原發和獨立的因素在DN的發病過程中起到不可忽視的作用［5］。細胞凋亡在DN早期可能對清除增生的多余細胞是有益的，但DN晚期腎臟細胞凋亡細胞數目往往與腎功能惡化程度呈正比。

內質網是重要的細胞器，它在蛋白質的合成、翻譯后修飾、折疊組裝等方面起重要作用。缺氧、氧化應激、內質網內Ca2+耗竭、蛋白質加工異常、某些蛋白表達過多等各種刺激可能引起內質網機能障礙，激活未折疊蛋白反應(UPR)，導致ERS［6］。適當的ERS可通過促進蛋白折疊、抑制蛋白合成來適應應激，但ERS持續存在或強度過大超過內質網所能承受的范圍時，則會對細胞造成損傷或觸發細胞凋亡信號途徑，誘導細胞的凋亡［7］。GRP78是ERS反應的標志性分子，半胱氨酸蛋白酶Caspase12途徑是內質網特有的凋亡途徑［8］。Paschen 等［9］在 1996年提出內質網的功能紊亂同細胞凋亡密切相關。Cybulsky等［10］強調ERS在腎小球損傷中的作用，認為無論體外還是體內因素刺激足細胞都可以誘導ERS。Toshiyuki等［11］將細胞破碎超速離心分為核、線粒體、微粒體(內質網膜)、溶解碎片，經免疫組織化學和Western印跡證實Caspase家族中僅Caspase12存在于內質網膜上。Mouw等［12］發現，敲除Caspase12的細胞雖然仍對其他各種凋亡誘導因素敏感，但對ERS誘導的凋亡卻產生耐受。Rammohan等［13］發現Caspase12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡，而其他死亡刺激仍可發生凋亡，這表明Caspase12與ERS介導的凋亡密切相關，與不涉及ERS的凋亡信號通路無關。因此ERS介導的細胞凋亡是不同于死亡受體及線粒體途徑的一種新的細胞凋亡途徑。

我們的研究通過構建STZ DM大鼠模型，通過檢測DN大鼠相關生化指標及腎臟組織中ERS標志分子GRP78及特有的相關凋亡因子Caspase12的動態性表達，來研究DN不同時期腎臟細胞的應激能力及相關的腎臟細胞凋亡情況與腎臟病變的程度的關系。結果發現，DM組24 h尿蛋白排泄量、血肌酐值較正常對照組明顯增加，同時隨著病程的延長，與DM 6周組比較，DM 12周組24 h尿蛋白排泄量、血肌酐值也相應增加;TUNEL法檢測DM組大鼠腎臟細胞的AI顯著高于對照組，且隨著病程的延長腎臟細胞的凋亡程度逐漸增加;研究還發現，在正常大鼠腎臟組織中，免疫組織化學和RT-PCR結果提示，GRP78和Caspase12有少量表達，主要分布在腎小球細胞及腎小管上皮細胞，在間質細胞也有表達，DM組大鼠腎臟組織中GRP78和Caspase12的表達較正常對照組明顯增高，并隨著病程的延長，GRP78和Caspase12的表達也相應增加，這表明ERS已被啟動，相關的細胞凋亡也相應出現，且與DM病程相關;同時GRP78蛋白的表達與腎臟細胞的凋亡程度、血肌酐水平、24 h尿蛋白量之間均呈正相關。

本研究結果提示，GRP78和Caspase12的動態表達可能與DN的進展密切相關，提示DM大鼠體內腎臟組織中ERS介導的凋亡途徑被激活。同時也提示內質網相關的凋亡與腎臟細胞的丟失有關，且隨著病程的延長，腎臟細胞的凋亡逐漸增加。這也提示了一種通過抑制內源性GRP78和Caspase12生成來延緩DN發展的新思路。DN的發病機制是多因素、多途徑的結果，若早期在ERS環節上加以干預，有可能為延緩DN的發展提供新的治療途徑。因此，臨床上可以采取相應措施，從而在某種程度上抑制腎臟細胞調亡，降低DM腎臟損害。

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