激動GHB受體對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制探討

楊其俠，秦 浩，郝 偉，賀大偉，谷淑玲

(1徐州醫學院，江蘇徐州221002;2棗莊市立醫院;3棗礦集團中心醫院)

γ-羥基丁酸(GHB)是腦內天然存在的抑制性神經遞質或調質，能自由通過血腦屏障。它由GABA轉化而來，其化學結構與GABA相似［1］。多項研究證實腦內存在特異性GHB受體。哺乳動物腦內GHB受體呈現不均勻分布，它專一表達于包括額葉皮層在內的整個大腦皮層、紋狀體、嗅束、丘腦及A9、A10、A12等多巴胺能神經核團［2］。最近的報道稱在大鼠腦內已克隆出GHB受體的cDNA［3］，并證實GHB受體屬于G蛋白偶聯受體(GPCR)大家族且存在多種亞型［4，5］。但關于 Gi蛋白在激動 GHB受體對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用中的變化，目前尚未見報道。我們于2008年3月～2010年7月進行本實驗，采用GHB受體選擇性激動劑NCS-356作為工具藥，觀察Gi蛋白在激動GHB受體對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用中的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 NCS-356，Sigma公司產品;Gi抗體，Sigma公司產品;AP標記羊抗兔血清二抗，北京中杉公司。江灣Ⅰ型C立體定位儀，上海第二軍醫大學修配廠;752紫外分光光度計，上海分析儀器廠;圖像采集及分析系統，德國Leica Qwin。

1.2 動物分組及模型制備 40只清潔級SD大鼠，體質量約250 g，隨機分為5組，分別是假手術組，缺血再灌注(I/R)組，NCS-356 160、320 和 640 μg/kg組。假手術組只分離動脈，不結扎、插線。其余組參照改良Longa法［6］制備缺血再灌注模型，具體方法:10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部手術區備皮，70%乙醇消毒，頸部正中切口，右側頸動脈鞘處分離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈，結扎翼腭突動脈、ECA及CCA，在CCA結扎處遠心端剪一斜切口，插入栓線(直徑0.20 mm單股尼龍線50 mm，將頭端加熱成球形，在光鏡下成光滑圓球，于線端18.5 mm處作標記)，進線17～21 mm時，感到明顯阻力，證明栓線頭端已達大腦中動脈起始處，開始計算缺血時間，在CCA插口結扎、固定栓線，逐層縫合。2 h后拔出栓線，即可得到前后交通動脈血供，此為再灌注期。模型制作成功的判定參照Longa 5分制評分標準進行神經功能評分，實驗過程中死亡或大出血、評分為0分和4分者均被剔除。

各組大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，矢狀切開頭皮至顱骨，以前囟為基點，后移1.5 mm、右移1.5 mm處鉆開顱骨，以顱骨表面為準，垂直進針4.5 mm，各組分別用微量注射器將10 μL藥物，假手術組不注射任何藥物，I/R組注射生理鹽水，NCS-356 160 μg/kg 組注射 NCS-356 40 μg，NCS-356 320 μg/kg 組注射NCS-356 80 μg，NCS-356 640 μg/kg 組注射 NCS-356 160 μg，均以 0.35 μL/min 速度注入大鼠側腦室，注射后留針10 min，再撤出微量注射器，骨蠟封閉小孔，常規局部消毒，縫合切口。40只大鼠腦缺血再灌注24 h處死后，取新鮮缺血腦皮層組織約100 mg(取視交叉前后約5 mm的缺血腦皮層組織)置于－70℃冰箱，Western blot法測定Gi水平。

1.3 神經功能評分 大鼠缺血再灌注24 h后采用5分制法［7］進行神經功能評分:①前肢蜷曲:提起大鼠尾巴時無屈曲癥狀者0分，輕度左前肢偏癱肩內收者0.5分，中度或重度左前肢偏癱肩內收者1.0分;②抗側推能力:自大鼠肩后向兩側推擋，阻力一樣者0分，阻力輕度減弱者0.5分，沒有阻力者1.0分;③身體轉圈:提起大鼠尾巴無轉圈者0分，向癱瘓側有輕度轉圈者0.5分，中度以上并有身體轉圈者1.0分;④自主活動的程度:大鼠活動正常者0分，自主活動較正常減少者1.0分，活動需要激惹的1.5分，失去自發活動能力者2.0分。大鼠評分為0分的予以剔除，并隨機補充，保證每組8只大鼠。分值越高說明大鼠行為障礙越嚴重。

1.4 Western blot法測定Gi含量 分別取各組樣品加入勻漿液進行勻漿，采用紫外吸收法進行蛋白含量測定。將蛋白處理液加入樣品中，100℃或沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。處理好的樣品置于－20℃冰箱中保存備用。采用5%的濃縮膠和10%聚丙烯酰胺分離膠，每孔加入30 μg蛋白樣品，置電泳緩沖液中，100 V電泳，條帶壓縮整齊后調至200 V，電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近停止電泳。將凝膠上的蛋白條帶轉移到NC膜上，蛋白膜放置到Western洗滌液中漂洗，再將轉移好的NC膜放入封閉液中搖床上室溫封閉1 h，吸盡封閉液后取出NC膜，放入1∶200兔抗大鼠Gi抗體液中搖30 min，再放4℃冰箱過夜。次日回收一抗，洗膜，加入1∶30 000 AP標記羊抗兔二抗稀釋液，振搖1 h，回收二抗，洗膜，將NC膜放入含NBT和BCIP的顯色液中，搖晃顯色，將顯色后的NC膜掃描，留做條帶灰度分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行統計分析，數據以ˉx±s表示，多組間比較采用完全隨機設計方差分析法(ANOVA)，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

大鼠神經功能評分及Gi含量檢測結果見表1。

表1 大鼠神經功能評分及Gi含量檢測結果(ˉx±s)

3 討論

Snead［4］發現GHB誘導由G蛋白介導的腺苷酸環化酶(AC)的減少是通過G蛋白偶聯的突觸前受體介導的，Ratomponirina也發現GHB受體結合位點能特異性被鳥苷酸和百日咳毒素所阻斷，以上結果支持腦內GHB受體屬于鳥嘌呤核苷酸(如Go或Gi)受體家族［5］。GHB 的鈉鹽 γ-羥丁酸鈉(SO)已被證實對大鼠缺血腦皮層神經元有保護作用，且SO的腦保護作用與激動GHB受體有關［8～11］。我們前期的研究證實，SO對大鼠局灶性腦缺血、沙土鼠全腦缺血和培養大鼠缺氧復氧皮層神經元具有神經保護作用，并初步證實該作用與GABA及其受體亞型有關［9，10］，但 GABA 受體阻斷劑僅能部分對抗 SO對腦缺血的保護作用，提示SO的腦保護作用不僅與GABA受體有關，可能還有其他的機制參與。我們在大鼠海馬腦片上發現，GHB受體特異性阻斷劑NCS-382也可部分對抗SO的腦保護作用，提示SO對腦缺血的保護作用既與激動GABA受體有關，又與激動GHB受體有關［11］。這為探討GHB受體在缺血性腦損傷中的作用奠定了很好的基礎。因此進一步探討GHB受體在缺血性腦損傷中所起的作用，以及在缺血性腦損傷中GHB受體可能的信號轉導通路很有必要。

本研究結果顯示，激動GHB受體可以改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的行為功能障礙，進一步證實了本實驗室及其他實驗室先前的結論［11］。實驗結果還顯示，I/R組大鼠缺血側大腦皮質Gi水平明顯低于Sham組，說明大鼠腦皮層細胞Gi水平改變可能參與了大鼠腦缺血再灌注的分子生物學發病機制。大鼠腦缺血前和再灌時給予GHB受體激動劑NCS-356，能升高大鼠腦缺血再灌注后皮層細胞的Gi含量，且隨其劑量的增加作用增強。以上結果提示，在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中激動GHB受體產生的腦保護作用與其激動Gi蛋白有關。

GPCR是研究最為廣泛的一類受體，他們組成不同功能的超大家族，目前已知的GPCR已多達1 000多種，而且數量還在增加。G蛋白是近年來在生物細胞膜發現的一組與三磷酸鳥苷(GTP)相結合的蛋白質，其主要功能是將激素或神經遞質信息由細胞膜外的受體傳遞至細胞膜內表面的效應器，在神經細胞的生長、分化、代謝及功能活動中發揮十分廣泛而基礎的作用，是胞外信號的轉導子和放大器，起著“分子開關”的作用。Gi是一種抑制性G蛋白，其信號轉導通路為Gi抑制AC的激活，從而抑制了AC催化ATP生成cAMP，進而抑制PKA的激活與p-CREB的生成。

在SO對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用中，可能是SO與細胞表面的Gi蛋白偶聯受體結合激活腺苷交換，G蛋白的α亞基和β、γ亞基復合體解離，解離后的α亞基抑制AC活性，從而改變細胞內第二信使如cAMP的水平，影響蛋白激酶活性進而影響特定蛋白磷酸化及基因表達。

GHB受體作為一種G蛋白家族偶聯受體，由于存在不同類型的G蛋白亞基，不同亞基通過不同通路產生不同的生物學效應，而本實驗僅研究了Gi蛋白在激動GHB受體對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用中的含量變化，希望進一步完善GHB對大鼠腦缺血保護作用的分子機制，為臨床治療缺血性腦損傷提供一個新的藥靶。但是腦缺血再灌注性損傷發病機制復雜，要全面了解激動GHB受體對腦缺血的保護作用機制還需做進一步深入的研究。

［1］Maitre M，Andriamampandry C，Kemmel V，et al.Gamma-hydroxybutyric acid as a signaling molecule in brain ［J］.Alcohol，2000，20(3):277-83.

［2］Maitre M.The γ-hydroxybutyrate signaling system in brain:organization and functional implications［J］.Prog Neurobiol，1997，51(3):337-61.

［3］Andriamampandry C，Taleb O，Viry S，et al.Cloning and characterization of a rat brain receptor that binds the endogenous neuromodulator gamma-hydroxybutyrate(GHB)［J］.Faseb，2003，17(12):1691-1693.

［4］Snead OC 3rd.Evidence of G protein-coupled gamma-hydroxybutyric acid receptor［J］.J Neurochem，2000，75(5):1986-1996.

［5］Ratomponirina C，Hodé Y，Hechler V，et al.gamma-Hydroxybutyrate receptor binding in rat brain is inhibited by guanyl nucleotides andpertussis toxin ［J］.Neurosci Lett，1995，189(1):51-53.

［6］Liu P，Wang JY，Li Q，et al.Effect of baicalin on HSP70 expression of hippocampal neurons in focal brain ischemia-reperfusion injury rats［J］.Acta Pharm Sin，2006，41(7):619-624.

［7］張均田，張慶柱.神經藥理學研究技術與方法［M］.北京:人民衛生出版社，2005:276-277.

［8］Vergoni AV，Ottani A，Botticelli AR，et al.Neuroprotective effect of gamma-hydroxybutyrate in transient global cerebral ischemia in the rat［J］.Eur J Pharmacol，2000，397(1):75-84.

［9］尤文彬，蔣新穎，馬行，等.羥丁酸鈉在大鼠海馬腦片缺氧/復氧損傷中的保護作用機制［J］.中國臨床藥理學與治療學，2008，(1):51-56.

［10］李梅，崔家勇，谷淑玲，等.羥丁酸鈉對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及與GABA的關系［J］.中國藥理學通報，2004，20(3):295-298.

［11］谷淑玲，尤文彬，馬行，等.γ-羥基丁酸受體在羥丁酸鈉保護大鼠海馬缺氧復氧損傷中的作用［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2006，20(2):91-95.