絲裂霉素水凝膠對兔晶狀體摘除術后后囊渾濁的防治作用

吳建峰，畢宏生，劉冬梅，蘇衛華，郭俊國

(1山東中醫藥大學，濟南250355;2山東中醫藥大學第二附屬醫院;3山東中醫藥大學眼科研究所)

白內障囊外摘除術后或晶狀體外傷后，殘留的晶狀體皮質或晶狀體上皮細胞(LEC)增生所形成的混濁，即后囊膜混濁(PCO)，是導致患者術后遠期視力下降的最主要原因之一。據Sundelin等［1］統計，白內障摘除術后5年內PCO發生率為43%，術后3～5年內有10% ～50%的患者需進一步手術處理。目前，臨床上的主要治療手段是行YAG激光后囊膜切開，但由于后囊破損干擾了正常的眼內結構，可能會導致一系列的并發癥，如人工晶體損傷、眼內壓升高、黃斑囊樣水腫，甚至視網膜脫離。因此，如能在術中采取必要措施防止PCO發生，降低并發癥的風險。2010年4月～2012年3月，我們通過囊外摘除兔眼晶狀體后在晶體囊袋內注入絲裂霉素(MMC)水凝膠，觀察其對PCO發生的抑制作用，篩選兼具療效與安全性的MMC水凝膠最佳濃度，并探討相關作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料 自制 MMC水凝膠［2，3］;健康成年新西蘭大白兔56只，雌雄不限，體質量2～2.5 kg，均排除眼病;超聲乳化儀(U2，美國愛爾康)及相關手術器材、耗材和藥品等。

1.2 手術方法 將實驗動物隨機分為7組，每組8只;右眼為手術眼，術前30 min復方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液點眼表面麻醉，氯胺酮、氯丙嗪25 mg/kg肌注麻醉。做3.2 mm透明角膜切口，前房內注入黏彈劑(1.5%透明質酸鈉，上海其勝)，連續環行撕囊，直徑約 6 mm，吸出晶狀體皮質。A組為對照組，術中不注入MMC水凝膠;B～G組為治療組，晶體皮質吸出后，先將黏彈劑充滿前房，保護角膜及虹膜等眼內組織;然后囊袋內注入MMC水凝膠0.1 mL，B組和C組、D組和E 組、F 組和 G 組囊袋內分別注入 0.2、0.4 、0.6 mg/mL的MMC水凝膠，各濃度兩組分別作用3、5 min后吸出。用10-0尼龍縫線縫合切口1針，術畢氧氟沙星滴眼液及紅霉素眼膏點眼。手術由同一人完成。術后予妥布霉素地塞米松滴眼液點眼，每日4次，連續2周。

1.3 觀察方法

1.3.1 眼前節觀察 術后第1天、3天、1周、1個月、3個月，行裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(結膜充血程度、角膜是否水腫、切口愈合情況等)。

1.3.2 后囊膜混濁觀察 術后1天、1周、1個月、3個月，通過裂隙燈觀察并記錄后囊增殖情況;后囊膜混濁程度分級:0級為透明;1級為輕度混濁，能看清眼底或混濁區面積小于1/2后囊膜面積;2級為中度混濁，能模糊見眼底或混濁面積大于1/2后囊膜面積;3級為完全混濁，無法看見眼底。

1.3.3 房水總蛋白檢測 術后第1天、1周、1個月，抽取各組術眼房水0.2 mL，用K5600微量分光光度計(KO，上海)檢測房水總蛋白含量。

1.3.4 角膜厚度測量 術后1周、1個月，采用DGH4000角膜測厚儀(JEDMED，美國)進行術眼的角膜厚度測量;每只眼測量3次，取平均值。

1.3.5 角膜內皮細胞計數 術后1周、1個月、3個月，用2000P角膜內皮計(TOPCON，日本)對術眼角膜內皮細胞計數并記錄。

1.3.6 組織病理學檢查 術后3個月，處死實驗動物后摘除眼球，置于10%甲醛溶液固定24 h以上，流水沖洗8 h;經梯度乙醇脫水后，進行浸蠟、包埋、切片，HE染色后顯微鏡觀察。術后3個月，處死實驗動物后摘除眼球;用冷生理鹽水洗凈眼球表面后，立即置于4%的戊二醛溶液中預固定40 min;在顯微鏡下將晶狀體囊膜取出，即刻置于固定液中固定3 h以上;用PBS溶液沖洗3次，1%鋨酸固定;環氧樹脂包埋，超薄切片，經鈾—鉛染色后透射電鏡觀察。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。所得數據進行等級資料(有序多分類資料)的Logistic回歸分析、方差分析和t檢驗等。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組術后眼前節反應情況 術后第1天各組結膜充血均較明顯，第5～7天基本消退;各組角膜均出現中度混濁，并有明顯房水混濁發生，術后第7～10天消失。

2.2 各組PCO發生情況 Logistic回歸分析顯示，MMC水凝膠治療組低于對照組(P均＜0.05);各治療組間比較P均＜0.05，且MMC濃度越高，PCO發生的比例和分級越低。見表1。

表1 各組術后1周、1個月、3個月PCO發病情況(只)

2.3 各組術后房水蛋白含量比較 術后第1天房水總蛋白含量，治療組均高于對照組(P均 ＜0.05);治療組中，G組房水蛋白含量最高，與 D、F組比較，P均＜0.05;F組與G組、D組與E組比較，P均＜0.05。術后第1周房水總蛋白含量，治療組均高于對照組(P均＜0.05);D、F組分別與B、E、G組比較，P均 ＜0.05;術后1個月，對照組、B組、C組均與F組和 G組間有差異(P均 ＜0.05)。見表2。

表2 各組術后房水總蛋白含量(mg/mL，ˉx±s)

2.4 各組術后角膜厚度比較 術后1周，除B組外，對照組與其余各治療組間角膜厚度比較，P均＜0.05;B組和C組、D組和E組、F組和G組比較，P均＜0.05。術后1個月，D、E、F組與對照組、B組、C組比較，P 均 ＜0.05;C、D、E、F組與 G 組比較，P均 ＜0.05。見表 3。

表3 各組術后角膜厚度比較(μm，ˉx±s)

2.5 各組角膜內皮細胞計數比較 見表4。

表4 各組術后角膜內皮細胞計數比較(個/mm2，ˉx±s)

2.6 各組術后組織病理檢查結果 術后3個月，HE染色后角膜基本恢復正常，內皮細胞排列緊密，房角結構正常。透射電鏡檢查顯示，對照組晶狀體上皮細胞結構完整，細胞器豐富，染色體分布均勻，呈功能活躍狀態;治療組晶狀體上皮細胞不同程度體積變小，細胞表面微絨毛消失，胞質濃縮，內有空泡形成，線粒體腫脹，嵴結構不清，染色體靠邊聚集，粗面內質網擴張。

3 討論

一般認為，PCO的發生是術后殘留的晶狀體上皮細胞在各種因素作用下發生增殖、分化、移行，使后囊出現白色混濁，阻礙光線通過［4］。也有學者發現［5］，赤道部上皮細胞保留了干細胞的特性，分化活躍，具有移行性，也是PCO發生的重要區域。

由于PCO的發生受多種因素影響，隨著手術方式的改進、人工晶體材料及設計的提高，都能在一定程度上減少其發生。但因不能徹底清除晶狀體上皮細胞，所以不能完全阻止PCO的發生。故針對引起PCO的根本原因，尋求適當的藥物防治措施，仍是研究的重要方向。目前，治療藥物主要有抗代謝藥、纖維蛋白溶解藥等。抗代謝藥物的基本原理是抑制晶狀體上皮細胞的有絲分裂，避免對非有絲分裂的毒性作用。用于實驗研究的藥物，有MMC、柔紅霉素、三氧化二砷、5-氟尿嘧啶、秋水仙堿等［6～8］。此類藥物均可抑制晶狀體上皮細胞的增殖，但由于有一定的眼內毒性，臨床應用受到限制。其中MMC可使術后角膜內皮明顯減少，角膜混濁明顯;柔紅霉素可在術后早期引起角膜、虹膜、睫狀體組織的炎性水腫;三氧化二砷可抑制晶狀體上皮細胞的生長并誘導期凋亡。纖維蛋白溶解藥肝素是較早被用做研究的藥物之一，它在臨床上已被較多使用，療效肯定，但有引起眼內出血的可能［9］。因此，安全性和有效性是PCO防治藥物或劑型研制的關鍵問題。

理想的藥物應當能有效抑制晶狀體上皮細胞增生，對眼內其他細胞無毒性作用，且臨床用藥應方便可行。晶狀體囊袋內灌注用藥，可使藥物與晶狀體上皮細胞接觸而發揮其抑制作用，是最直接的用藥途徑。MMC可與DNA分子的雙螺旋結構形成交聯，破壞DNA的結構和功能，抑制增殖期的DNA復制，對增殖各期細胞均有殺傷作用，同時也作用于靜止期細胞。本實驗發現，隨水凝膠制劑中MMC濃度增加，術后PCO發生率呈下降趨勢，且級別較低，因此認為MMC水凝膠囊袋內給藥對預防PCO的發生是有顯著效果的。

MMC眼內用藥由于血眼屏障的存在，進入血液循環的量極少，且0.05%的藥物質量濃度遠小于治療腫瘤時全身用藥劑量，故認為囊袋內用藥不會影響全身其他器官。眼前段用藥最直接的影響部位是角膜和虹膜，McDermott等［10］認為，MMC對角膜的影響與質量濃度有關。房水中的蛋白濃度是反映血—房水屏障功能的客觀指標之一，亦是評價眼前節炎性反應程度的依據，能夠反映MMC水凝膠對眼前節系統的毒副作用［11］。本實驗發現，即使最低濃度的MMC水凝膠也會對角膜和眼前節的血房水屏障產生影響，但這種影響比較輕微;在角膜內皮計數和房水蛋白含量的變化方面，在數值上差異并不大，這也能夠解釋為何通過裂隙燈和眼前節照相系統觀察到的角膜水腫與眼前節炎癥反應，對照組與治療組并無顯著差別。本實驗將MMC制成凝膠囊袋內給藥，即可使MMC充分與晶狀體上皮細胞接觸而發揮其抑制作用，又可以減少MMC對眼部組織的損害;另外，注入凝膠前已在前房注入黏彈劑，即能減少藥物向囊袋外的滲漏、保護眼前節組織，又能增加MMC與囊袋的接觸時間。

本研究也顯示，0.6 mg/mL的 MMC在抑制PCO的發生方面有最佳的療效。在不同作用時間組之間的比較中又發現，較長的MMC水凝膠留置時間，可能導致更明顯的角膜和血房水屏障的破壞作用，提示該制劑的眼內留置時間以較短(3 min)為宜;同時也提示隨眼內留置時間的增長，有更多的MMC彌散至前房。因此，改進制劑以控制這種彌散也是下一步研究的重要課題。

［1］Sundelin K，Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction ［J］.J Cataract Refract Surg，1999，25(2):246-250.

［2］畢宏生，蘇衛華，郭俊國，等.絲裂霉素C眼用凝膠的制備及質量控制［J］.生物醫學工程研究，2011，30(3):181-183.

［3］畢宏生，郭俊國，解孝鋒，等.清開靈眼用凝膠的制備與質量控制［J］.生物醫學工程研究，2010，29(1):62-64.

［4］Apple DJ，Solomon KD，Tetz MR，et al.Posterior capsular opacification［J］.Surv Ophthalmal，1992，37(2):73-116.

［5］Peng Q，Apple DJ，Visessook N，et al.Surgical prevention of posterior capsule opacification.Part2:enhancement of cortical cleanup by focusing on hydrodissection［J］.J Cataract Refract Surg，2000，26(2):188-197.

［6］王洪濤，施玉瑛，董喆.絲裂霉素C眼內應用抑制后囊膜混濁的實驗研究［J］.中國實用眼科雜志，2004，22(5):382-386.

［7］任曉冰.柔紅霉素抑制家兔后發性白內障的形態學研究［J］.眼視光學雜志，2003，5(1):4-7.

［8］關立南，劉平，李志堅.水分離時應用三氧化二砷抑制兔眼后囊膜混濁及其眼內毒性的實驗研究［J］.眼科新進展，2007，27(3):179-183.

［9］夏小平，陸道炎，王麗天，等.肝素抑制后發性白內障形成的臨床研究［J］.中華眼科雜志，1994，30(6):405-407.

［10］McDermott ML，Wang J，Shin DH.Mitomycin and the human corneal endothelium ［J］.Arch Ophthalmal，1994，112(4):533.

［11］羅莉霞，劉奕志，張新愉，等.超聲乳化白內障吸除術對血—房水屏障功能的影響［J］.中華眼科雜志，2004，40(1):26-29.