甲型流感病毒H1N1亞型HA基因的克隆及序列分析

鐘媚共，邱賢秀，向陽飛，吳崇超，王一飛

(1暨南大學生物醫藥研究開發基地，廣州510632;2暨南大學藥學院)

甲型流感病毒H1N1亞型是人類最常感染的流感病毒之一［1］。然而，目前對此種結合豬流感、人類流感的新病毒的流行病學了解很少。流感病毒表面血凝素(HA)是流感病毒合成的重要蛋白，病毒通過包膜上的HA吸附在宿主細胞表面，在蛋白酶的作用下，HA構象改變，病毒包膜與內體膜融合，脫殼，侵入細胞［4］。因此，HA蛋白是抗流感病毒藥物研發的關鍵靶點。同時，HA具有亞型特異性，可誘導特異性抗體的產生［5］。HA基因非常容易發生抗原漂移，可引起致病性更強的新型流感病毒出現［6］，使待測病毒與標準檢測抗體的交叉反應性差，疫苗的防治效果也難以達到預期，這給檢測及防治工作帶來極大的困難。我們于2011年11月～2012年8月進行本研究，克隆甲型流感病毒H1N1亞型血凝素HA基因，并對其進行序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 犬腎傳代MDCK細胞購自美國ATCC公司，由本實驗室保存;甲型流感病毒Influenza A/WSN/33(H1N1)由日本長崎大學生物醫學研究生院分子微生物和免疫學系傳染性病原體分子生物學實驗室饋贈，病毒在雞胚中活化增殖后，其滴度為10－4TCID50/mL，實驗用100 TCID50/mL。

1.1.2 菌種及載體 E.coli DH5α 菌株購自Promega公司，由本實驗室保存;載體pET 28a(+)質粒購自Novagen公司。

1.1.3 試劑 細胞培養用的MEM培養基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;用于病毒總RNA提取的TRIzol試劑購自Invitrogen公司;DEPC水購自廣州斯佳生物有限公司;逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker、1 kb DNA Marker、限制性內切酶 Hind Ⅲ和XhoⅠ及T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;KOD Plus Neo購自TOYOBO公司;膠回收及質粒小量抽提試劑盒購自OMEGA公司;TRYPTONE和YEAST EXTRACT購自OXOID公司;引物合成及重組質粒的測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.1.4 儀器 電熱恒溫隔水式培養箱及生化培養箱購自湖北黃石市醫療器械廠;倒置相差顯微鏡購自日本Olympus;低溫高速離心機購自德國Hettich公司;核酸蛋白分析儀購自 Beckman Coulter;PCR擴增儀購自美國MJ Research;凝膠成像分析系統購自英國Syngene公司;電泳儀購自北京六一儀器廠;臺式高速離心機購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank中公布的A/WSN/33流感病毒血凝素基因序列(GenBank Accession No.J02176.1)設計引物。上游引物P1:5'-CCCAAGCTTATGAAGGCAAAACTACTG-3'，下 劃線部分為 HindⅢ酶切位點;下游引物 P2:5'-CCGCTCGAGTCAGATGCATATTCTG-3'，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。加三蒸水溶解引物使之終濃度為10 μmol/L，－20 ℃保存。

1.2.2 病毒RNA的提取 MDCK細胞培養至單層，加入病毒液，37℃、5%CO2培養至當75%以上細胞出現病變時棄去培養液，按10 cm2細胞/mL TRIzol的比例加入TRIzol試劑，室溫放置5 min，使細胞充分裂解，按照試劑說明提取病毒總RNA［7］。

1.2.2 HA基因的PCR擴增與純化 利用Prime-Script RT reagent Kit的方法進行反轉錄，獲得cDNA為模板PCR擴增病毒HA基因，PCR反應體系如下:32 μL ddH2O，5 μL 10 × PCR buffer for KOD Plus Neo，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL P1，1.5 μL P2，5 μL 2 mmmol/L dNTPs，1 μL KOD Plus Neo，1 μL cDNA。反應條件為:94℃ 2 min、98℃ 10 s、61℃30 s、68℃ 50 s，29個循環，4℃至結束。1%PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收純化目的片段。

1.2.3 重組質粒的構建 根據質粒小量抽提試劑盒的方法抽提pET 28a(+)質粒，抽提產物－20℃保存。目的基因和pET 28a(+)質粒經HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收酶切產物，然后按照T4 DNA連接酶的反應體系16℃連接過夜。

1.2.4 轉化及重組質粒鑒定 將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，取100 μL轉化菌液涂布于含1‰卡那霉素的LB培養基瓊脂平板上，37℃倒置平板培養過夜。挑取單克隆接種于含1‰卡那霉素的液體LB培養基中，搖菌培養過夜。取200 μL單克隆菌液，離心，棄去培養液后用三蒸水重懸，100℃煮沸10 min后進行菌液PCR;剩余的菌液用質粒小量抽提試劑盒抽提重組質粒，進行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定。PCR產物和雙酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌液PCR和雙酶切鑒定正確后送華大基因科技股份有限公司測序。測序結果用NCBI平臺上的BLAST工具進行序列比對分析。

1.2.5 生物信息學分析 利用生物信息學方法對病毒HA基因進行分析:編碼閱讀框的預測采用ORF finder程序完成;蛋白的基本理化性質分析用Expasy的 ProtParam程序;蛋白疏水性計算用ProtScale程序;跨膜結構用TMHMM程序預測;信號肽預測經SignalP4.0程序進行;二級結構的預測用SOPMA方法進行;亞細胞定位用PSORT程序;蛋白的功能分類用ProtFun服務工具預測。蛋白的糖基化位點預測用NetNGlyc1.0服務程序完成。

2 結果

2.1 病毒HA基因的PCR擴增 將提取的總RNA反轉錄為cDNA后，以該cDNA為模板進行PCR擴增。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，在1 500～2 000 bp處獲得1條特異性擴增的條帶，大小約為1 700 bp。

2.2 HA基因的克隆與鑒定 目的基因經HindⅢ和XhoⅠ雙酶切及電泳回收后定向插入同樣雙酶切回收的pET 28a(+)質粒，轉化DH5α后挑取陽性單克隆進行菌液PCR鑒定，在約1 700 bp處有一特異性條帶;搖菌提取質粒進行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到載體條帶和目的基因條帶。見圖2。

圖1 PCR合成HA的DNA序列

圖2 重組pET 28a(+)-HA質粒限制酶分析

2.3 HA基因的序列分析 將初步鑒定正確的重組質粒送華大基因科技股份有限公司測序，測序結果表明重組質粒pET 28a(+)-HA成功構建，HA基因含1 698 bp的編碼區，編碼565個氨基酸。所得基因序列與GenBank上已登錄的甲型流感病毒WSN/33(H1N1)的HA基因序列進行比對，序列相似性達99%。兩個序列編碼的氨基酸序列比對后發現，其同源性同樣為99%，氨基酸殘基有1個位點存在差異，為399位G/R。此外兩個氨基酸序列都具有相似的保守區域，因此推斷本研究獲得的基因為病毒的HA基因。

2.4 生物信息學分析 對HA基因進行ORF finder分析，發現其mRNA序列中第33到第1 730個堿基之間存在1個1 698 bp的開放閱讀框。利用Expasy的ProtParam程序分析H1N1血凝素蛋白的基本性質，結果顯示HA基因編碼565個氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)有59個，堿性氨基酸(Arg+Lys)有56個，蛋白分子式為C2824H4359N765O856S25，相對分子量為 63 524.7 dal，理論 pI值為6.55;不穩定系數37.18，表明該蛋白較為穩定;總平均親水性為－0.379，是一個親水蛋白。運用ProtScale分析HA蛋白，得到其親/疏水性圖譜，結果HA蛋白中親水性氨基酸明顯較多，在整個氨基酸序列中均勻分布，整個多肽鏈表現為親水性，與Protparam分析結果一致。用TMHMM程序預測HA蛋白的跨膜區，發現HA蛋白中可能存在一個跨膜結構。SignalP4.0信號肽預測結果顯示，HA蛋白有一個信號肽結構。SOPMA分析結果顯示，血凝素蛋白的二級結構包括不規則卷曲(39.29%)、α-螺旋(32.21%)、延伸鏈(22.30%)和 β-轉角(6.19%)4 種形式，卷曲結構和螺旋結構散布于整個蛋白質中，構成HA蛋白二級結構的骨架。通過PSORT程序分析HA蛋白的亞細胞定位，發現HA蛋白最可能定位于病毒包膜上。通過CBS的Protfun工具預測分析HA蛋白的功能，結果顯示其為病毒包膜的組成成分。糖基化位點預測分析結果顯示，HA蛋白氨基酸序列共有7個 潛 在 糖 基 化 位 點，分 別 是-NNST-、-NSTD-、-NITG-、-NHTF-、-NASM-、-NGTY-和-NGSL-，位 于 第27、28、73、142、285、497 和 556 位，其中第 27 和 28位為重疊的糖基化位點。

3 討論

2009年墨西哥、美國爆發H1N1疫潮，疫情其后蔓延到全世界［2］。2009年6月WHO將全球流感大流行警告級別提升至最高等級第6級［3］。

流感病毒是一種單負鏈RNA病毒，其基因組由8個節段組成，第4節段編碼的血凝素蛋白HA是位于病毒囊膜表面的一種蛋白質［8］。HA可識別和結合靶細胞受體，參與細胞膜的融合，并可誘導特異性抗體的產生，因此，它在病毒的吸附和穿膜過程、病毒的致病力、宿主的特異性方面均起決定性作用，是目前研究最多和最深入的流感病毒基因［9～11］。

本研究結合分子生物學實驗技術和生物信息學分析方法，用RT-PCR法獲得甲型H1N1流感病毒血凝素HA基因序列，然后將其與pET 28a(+)質粒連接，通過PCR擴增、酶切和序列測定證實重組質粒構建成功。應用生物信息學對HA蛋白的理化性質、疏水性、二級結構、功能結構域、蛋白功能和同源性等進行預測分析，顯示HA基因開放讀框為1 698 bp，編碼565個氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)有59個，堿性氨基酸(Arg+Lys)有56個。編碼的蛋白親水性氨基酸較多，存在一個跨膜結構和信號肽，最可能定位于病毒包膜上。本研究工作有助于深入研究HA在病毒復制周期中的作用和意義，為流感病毒的快速準確檢測以及制備基因工程疫苗奠定基礎。

［1］Kumar S，Henrickson KJ.Update on influenza diagnostics:lessons from the novel H1N1 influenza A pandemic［J］.Clin Microbiol Rev，2012，25(2):344-361.

［2］張順祥.甲型H1N1流感流行病學研究進展［J］.中華流行病學雜志，2009，30(11):1125-1130.

［3］劉明，趙海波，田永強.2009甲型H1N1流感病毒研究進展［J］.生物技術通報，2010，7:41-43.

［4］ Hamilton BS，Whittaker GR，Daniel S.Influenza virus-mediated membrane fusion:determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion［J］.Viruses，2012，4(7):1144-1168.

［5］Ndifon W，Wingreen NS，Levin SA.Differential neutralization efficiency of hemagglutinin epitopes，antibody interference，and the design of influenza vaccines［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(21):8701-8706.

［6］Wu G，Yan SM.Mutation trend of hemagglutinin of influenza A virus:a review from a computational mutation viewpoint［J］.Acta Pharmacol Sin，2006，27(5):513-526.

［7］Rio DC，Ares M，Hannon GJ，et al.Purification of RNA using TRIzol(TRI reagent)［J］.Cold Spring Harb Protoc，2010，2010(6):pdb.prot5439.

［8］Norkin LC.Virology:Molecular Biology and Pathogenesis［M］.USA:American Society for Microbiology Press，2010.

［9］Ge H，Wang YF，Xu J，et al.Anti-influenza agents from Traditional Chinese Medicine［J］.Nat Prod Rep，2010，27(12):1758.

［10］Medina RA，Garcia-Sastre A.Influenza A viruses:new research developments［J］.Nat Rev Microbiol，2011，9(8):590-603.

［11］Jiang S，Li R，Du L，et al.Roles of the hemagglutinin of influenza A virus in viral entry and development of antiviral therapeutics and vaccines［J］.Protein Cell，2010，1(4):342-354.