酵母油脂及用于生物柴油制備研究進展

張國玲，杜 偉，劉德華

（清華大學化學工程系應用化學研究所，北京100084）

隨著自然資源和化石能源的消耗以及日益嚴重的環境問題，清潔可再生能源生物柴油，作為化石資源的可替代品，越來越受到各方的關注。生物柴油是有機脂肪酸酯類物質，通常由植物油或者動物脂肪等油脂類物質與短鏈醇經過酯交換反應得到[1]。生物柴油具有很多引人注目的優勢，如原料來源廣泛、可再生，燃燒充分，對環境友好等，這些優勢使得生物柴油具有很強的競爭力[1]。

目前我國生物柴油企業主要利用酸化油、地溝油、潲水油等作為生產生物柴油的原料，但這些低品質油脂的有效收集和運輸存在較大問題，而且價格波動也較大，這已成為限制我國生物柴油產業發展的最重要的制約因素之一。因此開發非食用油脂，如微生物油脂等，用于生物柴油的制備是近年來的研究熱點[2]。微生物油脂（單細胞油脂），是指由微生物在一定條件下產生并儲存在菌體內的甘油脂[3]。微生物生產油脂具有繁殖速度快，生產周期短，以及不受場地、氣候變化影響等優點[3]。來自美國國家可再生能源實驗室的報告指出，微生物油脂發酵可能是生物柴油產業和生物經濟的重要研究方向[4]。研究表明，酵母、薇藻、細菌、霉菌等微生物在適當條件下，可在菌體內產生積累大量油脂，其中，油脂酵母因其高產油能力而受到廣泛關注[5]。

酵母油脂的主要成分是甘油三酯，油脂的組成與植物油相似，研究表明酵母油脂可被用于生物柴油的制備[6]。為促進酵母油脂在生物柴油制備中的應用，目前大多研究主要集中于優化酵母油脂培養條件以及對酵母油脂合成關鍵基因進行解析，以提高酵母油脂含量，降低培養成本。研究表明，酵母油脂的積累受到發酵條件的影響，如培養基中的碳氮比、溫度、pH 值、氧氣含量、微量元素等，優化發酵過程以及尋求廉價碳源，對酵母油脂作為制備生物柴油的原料具有重要意義；同時，利用基因工程以及代謝工程對酵母菌株進行改造以提高酵母產油能力，具有極大的發展潛力[7]。另外，研究表明，由甘油二酯（DAG）生成甘油三酯（TAG）是TAG合成過程中的限速步驟[6]，對該過程中的關鍵基因進行解析是促進酵母油脂合成的關鍵。本文主要綜述了酵母油脂的組成及油脂合成影響關鍵因素以及酵母油脂用于生物柴油制備的研究進展，并對酵母油脂用于生物柴油制備的有關前景進行了展望。

1 酵母油脂組成

隱球酵母屬（Cryptococcus）、紅酵母屬（Rhodotorula）、油脂酵母屬（Lipomyces）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、耶氏酵母屬（Yarrowia）等在一定條件下均可積累油脂[8]。在限氮培養基中，Rhodosporidium sp.可以積累高達細胞干重70%以上的油脂[9]，Crptococcus sp.可以積累超過細胞干重60%的油脂[10]。根據文獻報道，酵母發酵產油脂可分兩個階段：菌體增殖期和油脂積累期[11]。在細胞增殖期，酵母需要消耗培養基中豐富的碳源和氮源，以保持菌體旺盛的代謝和增殖過程。當培養基中碳源充足而氮源缺乏時（高碳氮比），菌體細胞分裂速度迅速下降，細胞中的代謝活動以合成油脂為主，這個時期稱為油脂積累期。在油脂積累期，酵母基本上不再進行細胞增殖，而是將過量的碳水化合物轉化為脂類。

酵母油脂的脂肪酸組成以C16、C18系脂肪酸為主[12]，如棕櫚酸（16∶0），油酸（18∶1），亞油酸（18∶2）等，與大豆油（棕櫚酸6%～8%，油酸25%～36%，亞油酸52%～65%，亞麻油酸2%～3%，硬脂酸3%～5%，花生酸0.1%～0.4%）、棕櫚油（棕櫚酸約67%，油酸約17%，亞油酸約4%，硬脂酸約5%）等植物油的主要組成相似，可被用作生物柴油的原料油。

2 酵母油脂合成影響關鍵因素

研究表明，酵母油脂的合成主要受培養參數以及油脂合成過程中的關鍵酶及基因限制。培養基中的碳氮比、溫度、pH 值、氧氣含量、微量元素等都會影響到酵母油脂的合成，其中，碳氮比是影響酵母油脂合成的重要因素，有研究報道，當碳氮比從25 提高至70，酵母油脂含量可由18%增加至46%[13]。高碳氮比有利于油脂合成，為尋找合適的廉價碳源降低酵母油脂合成的成本，研究酵母對不同碳源的利用十分必要。同時，從代謝途徑探究影響油脂合成的關鍵基因，可以為改造菌體、提高酵母的產油能力提供基礎依據。

2.1 酵母油脂合成中的關鍵酶和基因

酵母油脂的合成代謝中，ATP∶檸檬酸裂解酶（ACL）和蘋果酸酶（ME）被認為是兩個關鍵酶[14]。當氮源缺乏時，油脂積累被過程被激活，AMP 脫氨酶活性增加，使得AMP 轉化為IMP 和NH4+，隨著AMP 濃度的下降，細胞的代謝及相關過程發生了改變[15]。AMP 濃度降低，使得細胞線粒體中的異檸檬酸脫氫酶（ICDH）活性降低或失活，這是因為在油脂酵母中，ICDH 是完全依賴AMP 的，ICDH 活性改變后，異檸檬酸通過蘋果酸/檸檬酸轉移酶，由線粒體內運出至細胞溶質中，然后在ACL 的催化下，裂解為乙酰輔酶A 和草酰乙酸[14]。ACL 活性與酵母中油脂積累有密切的聯系，ACL 是油脂積累的前提，但是具有ACL 的酵母并不一定是油脂酵母[16]。

在脂肪酸合成中過程中，不僅需要有ACL 催化反應所提供的乙酰輔酶A，還需要足夠的NADPH。ME 催化蘋果酸氧化脫羧，生成丙酮酸以及NADPH，這一過程產生的NADPH 只占總NADPH 的15%，但脂肪酸合成幾乎只能利用這一部分NADPH，當ME 的活性被抑制時，油脂積累也隨之下降，油脂積累的多少與ME 緊密相關[17]。研究細胞內ACL 和ME 的代謝調控，將有助于對油脂酵母進行改良，通過基因調控手段來提高油脂積累水平。

圖1 酵母S.cerevisiae 中由G-3-P 和DHAP 合成TAG 的代謝途徑

酵母所產油脂中，TAG 約占80%以上[17]。TAG由DAG 在甘油二酯酰基轉移酶（DAGAT）的催化下，通過酰化反應生成，該步驟是TAG 合成過程的限速步[6]。為進一步解析DAG 到TAG 過程中的關鍵基因，目前主要研究集中于基因背景清楚的啤酒酵母 Saccharomyces cerevisiae TAG 合成途徑（圖1）。

在S.cerevisiae 中，DAG 可在磷脂-甘油二酯酰基轉移酶（PDAT）的催化下，以磷脂為酰基供體，生成TAG，PDAT 由LRO1 基因編碼。DAG 也可在由DGA1基因編碼的酰基輔酶A-甘油二酯酰基轉移酶（DGAT）的催化下，以酰基輔酶A 為酰基供體，生成TAG[18]；這一過程中，由ARE1 和ARE2 基因編碼的酰基輔酶A-甾醇甘油二酯酰基轉移酶（ASAT）也表現出微弱的活性[19-20]。研究發現，在酵母細胞S.cerevisiae 的TAG 合成過程中，過量表達LRO1 基因可以使TAG 含量增加[21-22]。對處于生長穩定期的S.cerevisiae 細胞的研究發現，在缺少DGA1、ARE1 和ARE2 基因，而只表達LRO1 基因時，TAG 的合成水平為野生菌株的38%；然而，在敲除LRO1 基因的菌株中，TAG 的含量雖有所減少，但減少量不明顯[18]。進一步研究發現，敲除處于對數生長期的S.cerevisiae 的LRO1 基因后，TAG 含量與野生株相比顯著下降[22]。這表明LRO1 基因與TAG 合成有關，并且主要影響處于對數生長期的細胞中的TAG 合成。

然而，對處于穩定期的S.cereviseae 細胞研究發現，在缺少LRO1、ARE1 和ARE2 基因，只表達DGA1 基因時，TAG 的合成水平為野生菌株的87%，因此研究者認為在處于穩定期的S.cereviseae 細胞中，DGA1 基因是影響TAG 合成的主要基因。進一步對敲除DGA1 基因的菌株的研究結果也表明，TAG 含量以及脂肪酸總量與野生株相比顯著下降，因此在S.cereviseae 酵母的穩定期，DGA1 基因對TAG 合成發揮主要作用[18]。然而，也有研究表明，不同酵母細胞中DGA1 基因對TAG 合成的影響也有差異[23]。在Schizosaccharomyces pombe 細胞中發現，敲除DGA1 基因后，TAG 的含量與野生株相比并沒有差別，這主要是由于在它的TAG 合成過程中，如果缺少一種TAG 合酶，另一種酶會作出相應的補償[23]。

另外，研究發現，不同碳源對DGA1 基因表達也有較大影響。在Y.lipolytica 酵母中，敲除DGA1基因后，以葡萄糖為碳源的菌體內TAG 含量為野生株的90%，而以油酸為碳源的菌體內TAG 含量與野生株相比略有增加。進一步敲除LRO1 和DGA1基因后，以葡萄糖為碳源的菌體內TAG 含量降至野生株的30%，而以油酸為碳源的菌體內TAG 含量則為野生株的85%[23]。將處于對數生長期和穩定期的Y.lipolytica 細胞進行比較，發現Lro1p 活性下降了25%，而Dga1p 活性增加了20%[23]，這說明處于對數生長期的細胞內TAG 積累主要受LRO1 基因調控，而處于穩定期的細胞內TAG 積累主要受DGA1基因調控，與S.cerevisiae 中的情況一致。

還有研究表明，LRO1、DGA1、ARE1 和AREI2基因不僅與酵母中的TAG 合成過程有關，還對TAG的脂肪酸組成有影響。對于S.cerevisiae 中的LRO1、DGA1，ARE1 和ARE2 基因，只表達DGA1 基因時，脂肪酸組成與野生菌中的情況十分相似，而在只表達LRO1、ARE1 或ARE2 基因時，菌體中的脂肪酸組成則發生明顯改變，菌體中積累大量異油酸，棕櫚油酸含量也有所增加，而棕櫚酸含量減少[18]。另外，當缺少DGA1 基因編碼的酶時，酵母細胞中脂肪酸組成也會發生改變，這可能是受到菌株中TAG合成減少的影響[18]。綜上所述，LRO1、DGA1、ARE1和ARE2 基因同油脂合成有非常強的關聯關系。這些關鍵基因在不同酵母合成油脂過程中的作用是否具有普適性還有待于進一步考察。

2.2 利用不同碳源合成酵母油脂

除了從代謝途徑上解析關鍵酶和基因，還有大量研究集中于優化培養條件以提高酵母油脂的合成。其中，碳源是影響酵母油脂培養成本的重要因素，探討利用廉價碳源進行酵母油脂培養是近年來的研究熱點。一些廉價碳源如甘油、能源作物以及木質纖維素水解液等可作為酵母油脂的培養碳源（如表1）。

甘油是生物柴油生產、油脂皂化、酒精飲品制造等行業的主要副產物，對甘油的回收利用受到研究者們越來越多的關注。作為可再生資源之一，甘油可作為碳源用于酵母培養。對C.curvatus 的研究發現，利用粗甘油作為碳源，進行兩階段高密度培養，在生長階段胞的脂肪酸組成主要為C18∶2（亞麻油酸），是膜脂的主要成分；而在油脂積累階段，細胞脂肪酸的主要組成為C18∶0（硬脂酸）和C18∶1（油酸），是積累TAG 的主要成分。在優化的條件下，細胞干重可達69 g/L，油脂含量為48%[24]。研究者還將脫油后的酵母細胞加入培養基中作為碳源循環使用，使得整個過程更為經濟[24，31]。酵母Y.lipolytica 也可利用甘油作為碳源，并且生長狀況良好。在含有甘油的限氮培養基中生長時，油脂積累量隨甘油濃度增加而增加，最大油脂含量為31%，與穩定期相比，生長初期的酵母油脂中飽和脂肪酸含量較高[25]。

表1 廉價碳源用于酵母油脂合成

一些能源作物如木薯、菊芋等也可作為酵母油脂合成的碳源來源。木薯廣泛種植于熱帶及亞熱帶地區，對于疾病和干旱有較強的抵御能力，能夠在貧瘠的土地上生長，木薯粉含有約20%的直鏈淀粉和約80%的支鏈淀粉，可以水解為葡萄糖和低聚麥芽糖，被認為是用于制備生物柴油的重要原料來源。Li 等[26]利用木薯粉水解液培養酵母 R.mucilaginosa，在批次發酵和間歇補料發酵下油脂含量分別達到47.9%和52.9%。Wang 等[27]利用含木薯粉水解液的培養基培養R.toruloides 以制備油脂。在含木薯粉水解液8%的培養基中，油脂含量可達到63%。菊粉是天然果聚糖的混合物，作為植物根、莖中的貯藏多糖之一，含量十分豐富。近來菊粉作為可再生原料收到了人們的關注，然而，野生油脂酵母不能分泌菊粉酶，因而不能直接利用菊粉，需要利用菊粉酶將菊粉水解為還原糖。Zhao 等[28]分別利用菊芋浸膏和菊粉水解液培養R.toruloides，細胞油脂含量可達到40%和56.5%。Zhao 等[29]在Y.lipolytica 中表達菊糖酶基因INU1，使得菊粉可以被酵母直接利用，在搖瓶發酵實驗中，Y.lipolytica 利用菊粉作為碳源積累油脂達46.3%；在2-L 發酵實驗中，Y.lipolytica 分別利用菊粉和菊芋塊莖浸膏，積累油脂達48.3%和50.6%。

木質纖維素原料是自然界中最為豐富的有機物，可用作酵母發酵的碳源。以玉米秸稈為例，其主要成分為纖維素（37.5%），半纖維素（22.4）和木質素（17.6%）[32]，充分水解得到的混合糖中葡萄糖和木糖的質量比約為2∶1[33]。然而許多酵母并不能直接利用五碳糖進行發酵，某些酵母，盡管具有代謝五碳糖的能力，但是利用率較低。并且用混合糖作為碳源時，酵母往往優先利用更易于被代謝的葡萄糖，木糖代謝處于抑制狀態，只有當葡萄糖消耗到一定濃度以下，才啟動對木糖的代謝[34]。另外，木質纖維素水解液中含有抑制物，如醛類、酮類、酚類和有機酸類[35]。這些抑制物會對酵母的生長和發酵產生不利影響，降低酵母對營養物質的利用率，抑制目的產物的生成[36]。因此研究酵母對木糖或混合糖的利用以及對木質纖維素水解液中抑制因子的耐受性，對酵母發酵具有重要意義。

孔祥莉等[37]研究了酵母L.starkeyi 對木糖和混合糖的利用能力，發現該菌株利用木糖進行發酵時的產油能力與葡萄糖相當，并且可以同時轉化混合糖。以木糖作為碳源時，96 h 后菌體的油脂含量達到52.6%；以混合糖作為碳源時，120 h 后菌體的油脂含量達到52.6%[37]。楊登峰等[38]篩選獲得可用木質纖維素作為原料生產乙醇的酵母菌株Pichia caribbica。以木糖作為碳源時，木糖利用率為94.7%；以混合糖作為碳源時，木糖和葡萄糖利用率分別為94.2%和95.6%。Agbogbo 等[39]考察了用于乙醇生產的酵母P.stipitis 對混合糖的利用，隨著混合糖中木糖比例提高，細胞生長速度變緩，產物乙醇的得率略有上升。還有研究者提出可以通過構建重組菌來有效代謝五碳糖和六碳糖，將戊糖途徑引入代謝己糖良好的油脂酵母中，將產油脂關鍵酶引入能夠代謝混合糖的酵母菌種中[36]，或是通過原生質體融合獲得新菌株[40]，使得木質纖維素被高效利用。編碼木糖還原酶的XYL1 基因和編碼木糖醇脫氫酶的XYL2 基因是真菌木糖轉化途徑中的關鍵基因[41]，徐勇等[41]將XYL1 和XYL2 基因在S.cerevisiae 中表達，使之具有木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的活性。重組菌株可以木糖作為唯一碳源，乙醇得率達到理論值的37%。編碼木糖異構酶的XYLA基因是細菌木糖代謝途徑中的關鍵基因[42]。Walfridsson 等[43]首 次 將Thermus thermophilus 的XYLA 基因在S.cerevisiae 中表達，但由于木糖異構酶的最適反應溫度與發酵溫度不同以及重組酶的表達活性較低等原因，木糖異構酶的的活性僅為最適條件下的4%。涂振東等[40]利用原生質體融合和誘變育種的方法，得到了5 株P. guillermondii 和Candida shehatea 的突變菌株，其乙醇產量分別提高了37.7%、30.9%、15.7%、84.9%、47.1%。

研究開發對木質纖維素水解液中抑制物耐受的酵母菌種，或是對木質纖維素水解液進行預處理，降低抑制物對菌株的不利影響，也是提高酵母對木質纖維素利用效率的重要方面[44]。Limtong 等[45]研究了C.shehatae，P.stipitis 和Pachysolen tannophilus對醋酸的耐受性，當培養基中添加0.5%的醋酸，pH值為4.1 時，只有P.tannophilus 仍表現出活性；當培養基中醋酸的添加量為1%，pH 值為3.7 時，所有菌株的生長都受到抑制。Zhao 等[46]研究了S.cerevisiae、P.stipitis 和Pachysolen tannophilus 對糠醛和糠醇的耐受性，糠醛和糠醇均會對三株酵母菌株產生抑制作用，并且糠醛的毒性更大，可利用木糖進行發酵的酵母 P. stipitis 和 Pachysolen tannophilus 對糠醛更為敏感。Huang 等[30]首次利用硫酸處理過的稻稈水解液培養T.fermentans，在未經脫毒處理的水解液中，酵母油脂含量非常低；經過預處理除去水解液中的抑制物，在培養8 天后生物量可達28.6 g/L，油脂含量40.1%。因此，研究酵母對混合糖的高效利用，通過菌種改造和對木質纖維素水解液的預處理，提高菌株對抑制因子耐受力，是未來工業生物技術值得關注的領域之一，也是木質纖維素資源得以高效利用的前提。

綜上，探討利用包括木質纖維素在內的廉價碳源進行酵母油脂合成對降低油脂培養成本極為關鍵。進一步研究可集中于篩選優良菌株、對菌種進行改造以進一步提高其發酵性能以及優化反應器設計等以促進廉價碳源在酵母油脂合成中的應用。

3 酵母油脂制備生物柴油研究進展

根據所用催化劑的不同，制備生物柴油的方法主要集中于均相堿催化、酸催化和生物酶催化。同其它動植物油脂一樣，酵母油脂經過酯交換反應即可轉化成生物柴油，但目前對酵母油脂用于生物柴油制備的研究報道仍十分有限，各催化條件下不同酵母油脂制備生物柴油的得率如表2 所示。

均相堿催化方法是生物柴油制備過程中廣泛使用的生產工藝，具有反應速率快，產物得率高等優點[52]，但在反應中需要嚴格控制油脂中游離脂肪酸和水分的含量，減少副反應的發生。有學者探討了利用均相堿催化工藝轉化酵母油脂制備生物柴油的可能。Wang 等[27]利用堿催化法轉化酵母R.toruloides 的油脂時發現，超過85%的油脂可被轉化為生物柴油，并且生物柴油燃燒狀況良好。Wu 等[47]利用T.capitatum 積累的油脂進行堿催化反應，在醇油摩爾比為6∶1 時，甲酯得率達到了92%，并且生物柴油的冷濾點為-15 ℃，這為研究制備高質量的生物柴油提供了有效依據。Thiru 等[24]將酵母C.curvatus 中提取的油脂進行預處理，然后使用30%的甲醇鈉進行轉酯化反應，2 h 后生物柴油得率達到90%。在酵母油脂的提取和儲存過程中，由于受諸多因素影響，往往會導致酵母油脂里含有一定量的游離脂肪酸。有研究者利用游離脂肪酸含量較高的酵母L.starkeyi 的油脂進行兩步法轉化，首先使用甲醇進行預酯化，然后通過堿法催化進行酯化反應制備生物柴油[53]。還有研究者使用兩步法轉化酵母T.fermentans 的油脂，醇油摩爾比為6∶1，反應1 h后得率達到了92%[48]。在均相堿催化下，酵母油脂制備生物柴油的得率在短時間內即可達到較高水平。

表2 酵母油脂制備生物柴油

也有學者嘗試利用酸催化的工藝將富含游離脂肪酸的酵母油脂轉化成生物柴油，避免了堿法催化含酸油脂時的預酯化步驟，但酸法催化油脂制備生物柴油的反應時間相比堿催化方法有所延長。Dai等[49]利用硫酸催化從酵母R.gutinis 中提取的油脂，在醇油摩爾比為30∶1，反應5 h 后，生物柴油得率可達81.7%，并且與植物油制備得到的生物柴油組成相似。另外，為降低由酵母油脂制備生物柴油過程的成本，有研究者除去了從酵母中提取油脂的步驟。Liu 等[50]用硫酸催化酵母L. starkeyi 和R.toruloides，直接進行甲醇解反應制備生物柴油，20 h 后得率分別達到96.8%和98.1%。

近年來，環境友好的酶法工藝轉化可再生油脂制備生物柴油引起了人們的關注[54]。酶法制備生物柴油的反應條件溫和，整個反應過程中無有害物產生，不會對環境造成影響，產物與甘油通過靜置即可分離。里偉等[51]嘗試了生物酶催化R.toruloides酵母油脂制備生物柴油，反應分別在無溶劑體系和叔丁醇介質體系中進行，生物柴油得率可達90%。但利用酶法工藝也存在一些不足，如酶的成本較高，容易失活，重復使用的次數有限，這些問題都亟需研究者探尋合理的應對措施與解決方法。

綜上，在不同催化方法下，酵母油脂均可被利用進行轉酯化反應，這為制備生物柴油提供了更加廣泛的原料來源，對進一步研究生物柴油的生產應用有著重要意義，具有很大的發展前景。

4 酵母油脂用于生物柴油制備的前景展望

目前，全世界95%以上的生物柴油來自于食用植物油，主要是棕櫚油、大豆油、菜籽油以及向日葵油等[55]。隨著生物柴油產業的不斷增長，油脂原料的可持續性供應將成為生物柴油規模化發展的主要的瓶頸。

微生物油脂具有制備周期短，不需要占用耕地的優勢，因此，作為一種非糧油料，大力發展包括酵母油脂在內的微生物油脂對生物柴油產業發展具有重要意義。然而，在酵母油脂合成過程中，還急需解決如下問題：通常葡萄糖及淀粉質原料是包括酵母在內的產油微生物生長所需的最適碳源，但葡萄糖與淀粉質原料成本較高，不適于進行大規模的油脂生產，而且根據我國的現有國情，利用這些糧糖質原料，易造成“與人爭糧，與糧爭地”的局面[33]，由此產生多種社會及經濟問題。因此，研究者不斷探尋適合生物燃料油脂發酵技術需要的其它大宗原材料，如木質纖維素水解液、能源作物、工農業廢棄物中的有機質等。在未來的工作中，應從工程學角度，對原料前處理、發酵過程、后提取過程進行工藝優化以促進微生物油脂在生物柴油制備中的應用。另一方面，通過研究產油脂微生物的生長代謝規律及產油機理，改造菌株對不同原料底物的利用能力，還可通過生物技術獲得能夠分泌油脂及脂肪酸代謝衍生物的菌株，簡化對微生物油脂的分離提取工藝，降低能耗及成本，提高產物得率，對實現能源油脂的連續生產具有重要意義。

總之，盡管包括酵母油脂在內的微生物油脂目前還存在如上所述的系列工作亟待開展，隨著生物科學技術的發展以及對酵母油脂研究的不斷深入和完善，酵母油脂作為生物柴油的潛在原料，具有很好的開發前景。

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