抗氨甲酰化蛋白抗體的制備及其ELISA檢測方法的建立

彭方毅，徐建建，姜海蓉，伍 娟，楊海艷，周 歡

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶市江津區中心醫院，重慶 402260)

蛋白質翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)是指在mRNA被翻譯成蛋白質后，對蛋白質上個別氨基酸殘基進行共價修飾的過程。隨著年齡的增長，人體內積累了許多翻譯后修飾的蛋白質。目前報道較多的PTM方法有磷酸化、甲基化、糖基化、糖化、乙酰化、羥基化、泛素化、異構化和脫酰氨基作用，而關于氨甲酰化和瓜氨酸化的報道較少。不同的修飾方式涉及不同的氨基酸殘基，存在于不同的疾病生理病理過程中，它們常常伴隨多種自身免疫性疾病。

氨甲酰化(carbamylation/homocitrullination)是一種非酶介導的蛋白質翻譯后修飾(PTM)方式，其具體過程是蛋白質的賴氨酸(lysine，lys)殘基在尿素的衍生物——氰酸酯的作用下轉變成高瓜氨酸(homocitrulline，hcit)殘基(圖1)。此過程存在于尿毒癥［1］、腎衰竭(chronic renal failure，CRF)［2－3］、動脈粥樣硬化［4－5］和冠狀動脈疾病［6］中，可導致一些酶活性的喪失(如MMP2、TIMP-2、insulin)［7－8］。該過程既可以在體內發生，也可以在體外發生［2］。氨甲酰化蛋白已成為一個潛在的疾病生物標志物(biomarker)。

目前，對氨甲酰化蛋白中的Hcit的檢測方法主要以液相色譜 －質譜聯用法為主［9－11］，這些方法雖然靈敏、準確，但是樣品需要經過復雜的前處理，且操作費時，分析成本高，并不適合對大量樣品的檢測。酶聯免疫吸附分析(ELISA)具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強等優點，已在國內外被廣泛應用。針對氨甲酰化蛋白的ELISA分析能追溯到 20 世紀末［1，3，12］，但目前國內外都少見抗氨甲酰化蛋白抗體用于疾病診斷的報道。

圖1 氨甲酰化和瓜氨酸化

1 材料和方法

1.1 材料

牛血清白蛋白BSA(北京阿匹斯生物技術有限公司);瓜氨酸 cit(sigma);氰酸鉀KCNO(sigma);明膠Gelatin type B(fisher scientific);雞卵清蛋白OVA、鑰孔蟲戚血藍蛋白KLH、弗氏完全佐劑FCA、弗氏不完全佐劑FIA均購自Thermo;羊抗鼠IgG-HRP(thermo);羊抗兔IgG-HRP(北京中杉金橋生物技術有限公司);四甲基聯苯胺TMB(thermo);碳二亞胺 EDC(thermo);戊二醛 glutaraldehyde(sigma);BCA蛋白定量分析試劑盒(thermo);anti-citrulline兔多抗Ab6464(Abcam);數據處理軟件為GraphPad Prism 5.0;新西蘭大白兔由中國科學院遺傳與發育生物學研究所動物中心提供并負責飼養;BALB/c小鼠由重慶理工大學藥學與生物工程學院實驗室喂飼(SPF級)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫原Hcit-BSA的制備

合成方法參照文獻［13－14］進行。稱取0.0811 g KCNO，溶于10 mL 150 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，得到10 mL 0.1mol/L KCO溶液。稱取10 mg BSA，溶于10 mL 0.1 mol/L KCNO 溶液。37℃孵育17 h。然后將反應液裝入透析袋(MW:8000～14000)，9次換液，透析3 d。透析后離心，棄沉淀，上清液分裝保存于－20℃。用BCA法測定蛋白質濃度，SDS-PAGE法鑒定蛋白質純度。

1.2.2 包被原的制備

Hcit-OVA的制備同Hcit-BSA。

cit-G-OVA:平衡戊二醛至室溫;稱取5 mg BSA溶于1 mL 20 mmol/L PBS(150 mmol/L NaCl，pH=7.4)中得試劑 A;稱取5 mg cit溶于 2.5 mL Milli-Q中得試劑B;加入35μL 25% 戊二醛于試劑A和試劑B的混合液中，4℃反應2 h;加入177μL 0.4mol/L乙醇胺溶液終止反應;室溫靜置2 h;常規透析，BCA法測定蛋白質濃度，SDSPAGE法鑒定蛋白質純度。

cit-EDC-OVA:平衡 EDC 至室溫;取 500 μL 10 mg/mL OVA溶液為試劑A;稱取5 mg cit溶于1.25 mL Milli-Q中得試劑 B;溶解10 mg EDC于1 mL Milli-Q中，取250 μL EDC溶液加入試劑A和試劑B的混合液中;室溫反應2 h;常規透析，BCA法測定蛋白質濃度，SDS-PAGE法鑒定蛋白質純度。

1.2.3 抗體的制備

選用健康、6周齡的雌性BALB/c小鼠6只，健康純種新西蘭白兔2只。小鼠首次免疫和沖擊免疫劑量為 60 μg/只，其余均為 30 μg/只。兔子首次免疫和沖擊免疫劑量為200 μg/只，其余均為100 μg/只。首次免疫用注射器對抽法將弗氏完全佐劑與免疫原按體積比1∶1混合成油包水乳濁液制成新的免疫原，采用皮下多點免疫。以后換用弗氏不完全佐劑，每隔2周加強免疫1次。從第3次免疫后開始，每次免疫后第7 d采血，離心、收集血清，－20℃凍存。

1.2.4 間接ELISA測定抗體效價

用2 μg/mL的包被原包被 96孔酶標板，100 μL/孔，4℃過夜，洗滌 5次，拍干;加封閉液，200 μL/孔，25℃，2 h，洗滌 5 次，晾干;將抗血清倍比稀釋成不同濃度加入酶標板中，100 μL/孔，20℃，振板1 h，洗滌5次，拍干;加酶標二抗(鼠二抗 1∶10 000 稀釋，兔二抗 1∶5 000 稀釋)，20℃，振板1 h，洗滌 5次，拍干;加入 TMB顯色液，50 μL/孔，避光顯色 15 min;加入終止液 100 μL/孔;酶標儀讀取 OD450－650。

1.2.5 方陣實驗

將包被原稀釋成 2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 2、0.015 6 μg/mL，包被96 孔酶標板，100 μL/孔，4℃ 過夜，洗滌 5 次，拍干;加封閉液，200 μL/孔，25℃ 保持 2 h，洗滌 5 次，晾干;加入一抗，1∶500 開始倍比稀釋，100 μL/孔，20℃，振板1 h，洗滌5次，拍干;加酶標二抗(鼠二抗1∶10 000 稀釋，兔二抗1∶5 000 稀釋)，20℃，振板1 h，洗滌 5 次，拍干;加入 TMB 顯色液，50 μL/孔，避光顯色15 min;加入終止液100 μL/孔;酶標儀讀取 OD450－650。

1.2.6 間接競爭 ELISA(ic-ELISA)鑒定抗體特異性

根據方陣實驗的結果包被96孔酶標板，100 μL/孔，4℃過夜，洗滌 5次，拍干;加封閉液，200 μL/孔，25℃保持2 h，洗滌5 次，晾干;加入競爭物 20 μL/孔，抗血清 100 μL/孔，20℃，振板 1 h，洗滌5次，拍干;加酶標二抗(鼠二抗1∶10 000稀釋，兔二抗1∶5 000 稀釋)，20℃，振板1 h，洗滌5 次，拍干;加入TMB顯色液，50 μL/孔，避光顯色15 min;加入終止液 100 μL/孔;酶標儀讀取 OD450－650。

2 結果與分析

2.1 Hcit-BSA的濃度測定和純度鑒定

BCA法測得免疫原平均質量體積分數為1116.64 μg/mL(n=4)。SDS-PAGE 結果表明成功合成完全抗原Hcit-BSA(見圖2)。

圖2 Hcit-BSA的SDS-PAGE結果

2.2 抗血清效價測定

間接ELISA結果表明抗血清只識別Hcit-OVA，不識別cit-G-OVA和cit-EDC-OVA(見圖3)。而同樣條件下，商品化的 anti-citrulline兔多抗Ab6464(免疫原為cit-G-BSA)只識別cit-G-OVA，不識別Hcit-OVA和cit-EDC-OVA(見圖4)。2種抗體均只能識別一種偶聯方式的包被原，并未見有交叉反應。在經免疫的小鼠和兔子中，僅19號小鼠才有效價，第5次采血抗血清效價大于1∶8 000(見圖 5)。

圖3 不同包被原的篩選結果

圖4 Anti-citrulline兔多抗Ab6464的特異性鑒定

圖5 小鼠效價測定結果

2.3 抗血清方陣實驗

方陣實驗結果表明抗體最佳稀釋倍數為1∶4 000，Hcit-OVA 最佳包被濃度為 0.25 μg/mL(見圖6)。

圖6 19#B5方陣實驗結果

2.4 抗體特異性鑒定

間接競爭ELISA結果表明抗血清特異性識別氨甲酰化產物(carbamylation-derived products，CDPs)，對 Hcit-KLH和 Hcit-BSA優于 Hcit-OVA，與KLH、BSA和OVA均無反應(見圖7)。2個結果表明，最低檢測限還有待提高。

圖7 19#B5間接競爭ELISA結果

3 討論

合成的 Hcit-BSA具有較強免疫原性，使BALB/c小鼠產生了Anti-CarP。抗體能特異性識別CDPs(如 Hcit-BSA、Hcit-OVA 和 Hcit-KLH)，與cit-G-OVA、cit-EDC-OVA、BSA、OVA 和 KLH 均無反應。而anti-Citrulline兔多抗Ab6464只識別戊二醛偶聯方式的 cit(cit-G-OVA)，與 cit-EDCOVA、Hcit-OVA均無反應。2種抗體都只能識別特定偶聯方式的包被原，并未見有交叉反應。結果表明所得到的抗血清是氨甲酰化蛋白所特異的，而anti-Citrulline兔多抗Ab6464是cit-G所特異的，而不是cit所特異的。

除了已提到的疾病外，研究者在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)和預測性關節損傷病人血清中也發現了抗氨甲酰化蛋白的自身抗體。Jing Shi［15］等在超過45%的RA病人血清中檢測到抗氨甲酰化抗原IgG類抗體，在超過43%的RA血清中檢測到抗氨甲酰化蛋白IgA類抗體。他們研究認為在RA病人血清中的自身抗體除了抗瓜氨酸蛋白抗體(antibodies against citrullinated protein antigens，ACPA)之外，還有 anti-CarP存在，它為RA的檢測提供了一個新的可能。同樣，Sanna Turunen等［16］用氨甲酰化的蛋白免疫兔子，獲得的抗血清既識別含高瓜氨酸的蛋白多肽，也識別含瓜氨酸的蛋白多肽，認為氨甲酰化的蛋白也能引起機體產生抗瓜氨酸化的自身抗體。但是，本研究用了24種含cit的多肽片段對血清和商品化anti-citrulline兔多抗Ab6464進行篩選，均未見明顯反應(數據未給出)。因此氨甲酰化與瓜氨酸化之間的關系還有待進一步研究。

針對氨甲酰化與疾病的關系，目前已有一些新發現。Mydel P，Wang Z 和 Brisslert M［17］等評估了氨甲酰化在引發機體免疫應答中的作用，結果表明經氨甲酰化蛋白免疫的小鼠更容易引發關節炎癥狀，認為賴氨酸的氨甲酰化可能是引發炎癥反應的一個重要途徑。有研究發現在3H綜合癥(hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria syndrome，HHH syndrome)病人中，高瓜氨酸Hcit和鳥氨酸(Ornithine，Orn)可能涉及到神經性損傷［18－19］。在疾病預防方面，Ghaffari M A 和Shanaki M［20］在體外研究了3種維生素對低密度脂蛋白(LDL)氨甲酰化抑制的情況。結果顯示維生素C、維生素E和番茄紅素都能抑制LDL氨甲酰化，其中番茄紅素的抑制作用最強，而維生素能降低尿毒癥病人患動脈粥樣硬化的風險。隨著研究的不斷深入，氨甲酰化將逐步受到重視。

本實驗采用常規雜交瘤技術有望制備出anti-CarP單克隆抗體，引入生物素－親和素系統可將最低檢測限提高到ng級別及以上，可大大提高檢測的靈敏度和特異性。建立了ELISA檢測方法，開發出氨甲酰化蛋白檢測試劑盒，有助于進一步探究氨甲酰化與瓜氨酸化之間的關系，有可能實現對尿毒癥、腎衰竭、動脈粥樣硬化等疾病的快速早期檢測。

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