白血病細胞中NF-κB的活化狀態及其對細胞凋亡的影響

馮金，劉小勇

（柳州市柳鐵中心醫院檢驗科，廣西柳州545007）

白血病細胞中NF-κB的活化狀態及其對細胞凋亡的影響

馮金，劉小勇

（柳州市柳鐵中心醫院檢驗科，廣西柳州545007）

目的探討白血病細胞株中核轉錄因子NF-κB的活化狀態及其對白血病細胞凋亡的影響。方法流式細胞術檢測白血病細胞及對照組細胞PBMC凋亡率；雙熒光素酶報告基因檢測各組細胞NF-κB相對活性；NF-κB抑制劑PDTC作用12 h后檢測各組白血病細胞NF-κB相對活性及細胞凋亡率的變化。此外，qPCR及Western Blot分別檢測各組細胞凋亡相關蛋白Bax及Bcl-2的mRNA及蛋白水平的改變。結果與PBMC比較，各組白血病細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)；雙熒光素酶報告基因結果顯示各組白血病細胞的NF-κ B活性顯著高于PBMC(P＜0.05)；PDTC作用后各組白血病細胞NF-κB活性明顯下降，細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)；同時，各組白血病細胞Bax的mRNA及蛋白表達水平均明顯增高(P＜0.05)，而Bcl-2的表達水平明顯降低(P＜0.05)。結論白血病細胞中存在NF-κB的持續性激活，其激活可導致白血病細胞凋亡受阻。

白血病；NF-κB；細胞凋亡

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，是國內十大高發惡性腫瘤之一，也是兒童和青少年發病率和病死率最高的惡性腫瘤。改善這一類疾病的療效將極大提高人們的生活質量。然而，臨床上白血病的化療常常出現耐藥，其可能與白血病細胞凋亡受阻有關[1]。多種實體腫瘤研究表明，核轉錄因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)持續升高導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐受，是腫瘤耐藥的重要原因[2]。NF-κB是一類能與多種基因啟動子或增強子κB位點發生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質。在正常造血細胞中，NF-κB信號通路通常處于非活化或低活化狀態[3]。有研究發現，白血病細胞中有高表達的NF-κB[4]。那么，高表達的NF-κB是否介導了白血病細胞的凋亡受阻？為此，本課題通過檢測NF-κB在白血病細胞中的活化狀態，探討其對白血病細胞凋亡的影響，以期為白血病的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞系及質粒人慢性髓性白血病急變K562細胞、人急性單核白血病THP-1細胞和急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞均購自上海生命科學院細胞庫，本室常規保存。取正常人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)為對照。海腎熒光素酶表達載體pRL-TK質粒購自Promega公司；pNFκB-TA-luc質粒購自碧云天生物科技研究所。

1.2 試劑胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養基購于美國Gibco公司；Ficoll淋巴細胞分離液購自上海Sangon生物工程公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒為中國凱基生物制品；xfectTM轉染試劑購于美國clontech公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒購自Promega公司；TRIzol、qPCR試劑盒購自Takara公司；小鼠抗人Bax、Bcl-2單抗購于美國bioworld公司；羊抗小鼠IgG抗體購于北京中杉金橋公司；比格烷二硫代氨基甲酸鹽(Pyrrolidine dithiocarbam-ate，PDTC)購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養K562、THP-1和HL-60細胞均用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/m1)、鏈霉素(100 U/m1)的RPMI 1640培養液，培養于含5%CO2的37°C恒溫培養箱中，取對數生長期的細胞進行實驗。采用Ficoll密度梯度離心法分離出PBMC為對照。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡收集對數生長期各組細胞(1～5)×105個，PBS洗滌3次后，重懸于500 μl反應緩沖液中。于上述緩沖液中加入5 μl Annexin V-FITC并充分混勻；再加入5 μl PI染液，混勻；室溫避光反應5～15 min，立即上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復三次。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測細胞NF-κB活性將對數生長期各組細胞(8×105)接種于6孔板中，采用xfectTM轉染試劑將5 μg pNFκB-TA-luc質粒及0.5 μg pRL-TK Vector(轉染效率內參)共轉染各組細胞，培養于含5%CO2的37℃恒溫培養箱中。轉染第48 h檢測各組熒光素酶的活性。根據Promega試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System技術手冊進行操作，以pRL-TK為內參，通過Turner TD20/20 luminometer檢測儀檢測熒光強度。以蟲熒光素酶活性(pNFκB-TA-luc)和海腎熒光素酶活性(pRL-TK)的比值(FL/RL)來表示NF-κB相對活性。實驗重復三次。

1.3.4 qPCR檢測各組細胞Bax及Bcl-2的mRNA水平收集各組細胞，Trizol抽提總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行PCR檢測。以人β-actin為內參，qPCR法檢測各組細胞Bax及Bcl-2 mRNA的表達。反應引物序列見表1。qPCR擴增條件為：95℃預變性30 s后，94℃10 s，55℃20 s，72°C 30 s，循環35次。循環結束后進行融解曲線分析。用2-△△CT值表示基因的相對表達量。實驗重復三次。

表1 PCR反應引物序列

1.3.5 Western blot檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達收集對數生長期各組細胞，提取細胞總蛋白，Bradford法測蛋白濃度。取80 μg細胞蛋白提取液，用12%的分離膠分離蛋白質，濕轉轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉3 h，分別與兔抗人Bax及Bcl-2單克隆抗體(1:500稀釋)4℃孵育過夜后，與二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，l:1 000稀釋)孵育1 h，洗滌后用化學發光進行顯色。實驗重復三次。

2 結果

2.1 流式檢測細胞凋亡率流式檢測K562、 THP-1、HL-60細胞及PBMC細胞凋亡率，結果發現，三組白血病細胞的凋亡率分別為(2.15±0.35)%、(1.82± 0.42)%、(1.15±0.37)%，明顯低于與對照組細胞凋亡率的(5.78±0.39)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 流式細胞術檢測白血病細胞的凋亡率

2.2 雙熒光素酶報告基因檢測細胞NF-κB活性熒光素酶報告基因檢測K562、THP-1、HL-60細胞及PBMC細胞NF-κB相對活性的改變。，各組白血病細NF-κB活性分別為(1.54±0.45)、(1.62±0.37)、(1.49±0.55)，顯著高于對照組細胞，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 熒光素酶報告基因檢測白血病細胞NF-κB的相對活性

2.3 PDTC作用后白血病細胞NF-κB活性的改變用100 μmol/L的PDTC處理各組白血病細胞后12 h后雙熒光素酶報告基因檢測細胞NF-κB活性的改變，結果發現，PDTC作用后各組細胞的NF-κB活性均顯著下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 PDTC作用后的白血病細胞凋亡率的改變PDTC抑制白血病的NF-κB活性后是否影響各組細胞的凋亡？流式檢測PDTC處理12 h后白血病細胞凋亡率的改變，結果發現，各組細胞的凋亡率較抑制劑處理前顯著增高(P＜0.05)，見表2。

圖3 PDTC處理后白血病細胞NF-κB的相對活性

表2 PDTC處理白血病細胞凋亡率的改變

表2 PDTC處理白血病細胞凋亡率的改變

注：aP＜0.05，無PDTC處理組細胞與PDTC處理組細胞比較。

組別PDTC(-)PDTC(+) Bax Bcl-2 β-actin 2.15±0.35 1.82±0.42 1.15±0.37 6.23±0.73a4.18±0.27a4.55±0.31a

2.5 PDTC作用后白血病細胞及Bcl-2的mRNA水平的改變qPCR檢測PDTC作用前后各組白血病細胞Bax及Bcl-2 mRNA表達水平的改變。結果顯示：PDTC作用后，各組白血病細胞的Bax mRNA水平較藥物作用前均顯著增高，Bcl-2的表達在藥物作用后均明顯下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 PDTC作用后白血病細胞Bax、Bcl-2 mRNA表達水平的改變

2.6 PDTC作用后白血病細胞Bax及Bcl-2蛋白表達的改變Western blot進一步檢測各組白血病細胞在PDTC作用后Bax及Bcl-2蛋白水平的改變。與為未處理組比較，PDTC作用后，各組白細胞Bax的蛋白水平均顯著增高，而Bcl-2表達水平明顯降低，差異具有統計學意義，見圖5。

圖5 PDTC作用后白血病細胞Bax、Bcl-2蛋白表達水平的改變

3 討論

腫瘤細胞抵抗凋亡往往導致化療耐受[5]。探究這一類患者化療耐受的機制將極大提高該類人群的治療效果及生活質量。已知NF-κB的持續性活化是導致多種腫瘤耐藥的主要原因[6]。本研究檢測了NF-κB在各類型白血病細胞中的表達狀態，并探討其表達對白血病細胞凋亡的影響，從而白血病的治療提供可能的策略。

實驗中我們選取人慢性髓性白血病急變K562細胞、人急性單核白血病THP-1細胞和急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞為研究對象，同時選取PBMC為對照，檢測各組細胞凋亡水平。結果發現，與對照組相比，各組白血病細胞明顯降低。我們進一步檢測各組細胞NF-κB轉錄活性的表達。結果顯示，各組白血病細胞的NF-κB轉錄活性較對照組明顯升高，提示白血病中持續性高表達的NF-κB可能是導致白血病細胞抵抗凋亡的原因之一。

為進一步證實白血病細胞中活化的NF-κB導致細胞抵抗凋亡，將NF-κB信號的抑制劑PDTC處理各組白血病細胞。PDTC是一種具有抗氧化劑作用的、有效的NF-κB抑制劑[7]。本研究中，PDTC作用12 h后，各組白血病細胞的NF-κB活性明顯下降。進一步檢測各組細胞凋亡率，結果發現，各組白血病細胞凋亡在PDTC處理后明顯增高。此外，我們還檢測各組細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達水平的改變。結果顯示，PDTC處理后白血病細胞Bax的mRNA及蛋白表達水平均明顯升高，而Bcl-2的表達水平明顯下降。以上結果進一步證實NF-κB活化抵抗了白血病細胞凋亡。

總之，在白血病中存在NF-κB的異常激活，其通過抵抗細胞凋亡而導致臨床上對白血病的治療預后差，這為臨床白血病的治療提供新的靶點。此外，本研究中的PDTC可下調NF-κB信號通路的活性，并誘導細胞凋亡，提示PDTC可能是治療白血病的一個有效途徑，有必要進一步的研究與開發。

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[6]Braun T,Carvalho G,Coquelle A,et al.NF-kappa B constitutes a potential therapeutic target in high-risk myelodysplastic syndrome [J].Blood,2006,107(3):1156-1165.

[7]Gupta SC,Sundaram C,Reuter S,Aggarwal BB.Inhibiting NF-κB activation by small molecules as a therapeutic strategy[J].Biochim BiophysActa,2010,1799(10-12):775-787.

Activation condition of NF-κB in leukemia cells and its effect on cellular apoptosis

FENG Jin,LIU Xiao-yong. Department of Laboratory Medicine,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the activation condition of NF-κB in leukemia cells and its effect on cellular apoptosis.MethodsFlow cytometry was used to detect the apoptosis of leukemia cells and peripheral blood mononuclear cell(PBMCs).The relative activities of NF-κB in the cells were assessed by luciferase reporter assays. After treated by PDTC(the inhibitor of NF-κB)for 12 h,the activation condition of NF-κB and apoptosis in leukemia cells were analyzed.In addition,the mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2 were analyzed by qPCR and Western blot,respectively.ResultsCompared with PBMCs,cellular apoptosis in leukemia cells were significantly decreased(P＜0.05).The results of luciferase reporter showed that the relative activities of NF-κB were tly higher in leukemia cells than PBMCs(P＜0.05).Upon PDTC treatment for 12 h,the relative activities of NF-κB in leukemia cells were significantly decreased,while cellular apoptosis were significantly increased(P＜0.05).Additionally,the mRNA and protein expression of Bax in leukemia cells were significantly increased(P＜0.05),while the mRNA and protein expression of Bcl-2 were remarkably decreased(P＜0.05).ConclusionConstitutively activated NF-κB exists in the leukemia cells,and it's constitutively activation induces cellular apoptosis resistance.

Leukemia;NF-κB;Apoptosis

R733.7

A

1003—6350（2013）06—0785—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0337

2012-10-30)