JunB在實驗性支氣管哮喘中的作用

李海燕，郭琦，陳如沖，周一平，李明，喻海瓊，江梅

(1.廣東醫學院附屬福田醫院社康部，廣東深圳518033；2.廣東醫學院附屬福田醫院呼吸科，廣東深圳518033；3.廣州呼吸疾病研究所(呼吸疾病國家重點實驗室)，廣東廣州510120)

·論著·

JunB在實驗性支氣管哮喘中的作用

李海燕1*，郭琦2*，陳如沖3，周一平2，李明2，喻海瓊2，江梅3

(1.廣東醫學院附屬福田醫院社康部，廣東深圳518033；2.廣東醫學院附屬福田醫院呼吸科，廣東深圳518033；3.廣州呼吸疾病研究所(呼吸疾病國家重點實驗室)，廣東廣州510120)

目的探索激活蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)家族成員中參與構成哮喘病理生理特征的關鍵亞單位，為哮喘治療提供更精確和新穎分子靶點。方法建立大鼠哮喘模型。130只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、哮喘空白組、c-Jun反義寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs)組、JunB AS-ODNs組、JunD AS-ODNs組、c-Fos AS-ODNs組、FosB AS-ODNs組、Fra-1 AS-ODNs組、Fra-2 AS-ODNs組和無義寡核苷酸(Nonsense ODNs，NS-ODNs)組。實施基因沉默后，HE染色計數支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞(Eosinophils，EOS)百分比，逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測白介素(Interleukin，IL)-5 mRNA表達。結果JunB AS-ODNs組的EOS百分比[(13.39±3.72)%]顯著低于哮喘空白組[(34.33±9.62)%]，差異有統計學意義(P＜0.001)，但仍高于正常對照組[(5.61±1.76)%]，差異有統計學意義(P＜0.05)。其余ODNs組的EOS百分比與哮喘空白組的差異均無統計學意義(P＞0.05)。與哮喘空白組比較，JunB AS-ODNs組的IL-5 mRNA表達被顯著抑制[(0.554 2±0.082 9)vs(0.822 4±0.066 0)，P＜0.001]，但亦仍高于正常對照組[(0.323 7±0.057 7)，P＜0.001]。其余ODNs組IL-5 mRNAs表達與哮喘空白組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論在轉錄因子AP-1家族中，JunB亞單位可能決定哮喘大鼠氣道慢性炎癥，可能是新穎治療靶點。

激活蛋白-1；亞單位；反義寡核苷酸；支氣管哮喘

近40年來，哮喘發病率、病死率和經濟負擔急劇上升，尤其在兒童中。全球目前大約3億人患有哮喘，且其流行趨勢是每10年增加50%[1]。盡管發布了2012年全球哮喘防治創議(Global initiative for asthma，GINA)更新版，但用于治療的控制劑和緩解劑尚無本質突破。

哮喘氣道炎癥的中心效應細胞是Th2細胞[2]。激活蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)調節Th2細胞因子白介素(Interleukin，IL)-5表達[3]。AP-1活化失調導致臨床糖皮質激素抵抗型哮喘[4]。AP-1是變應性氣道炎癥的重要治療靶點[5]。我們以往的研究揭示：AP-1順式誘騙元件能在體外顯著抑制佛波醇肉豆蔻酸鹽(Phorbol myristate acetate，PMA)誘導的哮喘大鼠和哮喘患者外周血T細胞AP-1核轉位和IL-5轉錄[6-7]。Desmet等[8]亦證實該順式誘騙元件能顯著抑制實驗性哮喘所有病理生理特征，即嗜酸性粒細胞性氣道炎癥、氣道高反應性、黏液細胞增生、變應原特異性免疫球蛋白分泌、Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)和eotaxin的合成。AP-1是由Jun(c-Jun、JunB和JunD)和Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)亞單位組成的二聚體蛋白[9]。AP-1分布有其細胞特異性。每個家族成員間的功能有重疊而能相互代償，但它們能介導特異而互不重疊的功能[10]。干預AP-1某個亞單位，可能既能抑制哮喘諸多病理生理特征，又不至于過多破壞組織和器官穩態。

本文選用大鼠哮喘模型，通過基因沉默技術，探索AP-1家族成員中參與構成哮喘病理生理特征的關鍵亞單位，為哮喘治療提供更精確和新穎分子靶點，并初步揭示該亞單位參與哮喘發病的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源及分組130只健康雄性Wistar大鼠(體重為200～250 g)由廣東省實驗動物醫學中心提供。隨機分為正常對照組、哮喘空白組、c-Jun反義寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs)組、JunB AS-ODNs組、JunD AS-ODNs組、c-Fos AS-ODNs組、FosB AS-ODNs組、Fra-1 AS-ODNs組、Fra-2 AS-ODNs組和無義寡核苷酸(nonsense ODNs，NS-ODNs)組，每組13只。

1.2 試劑卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、TRIzo試劑、逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒均購于Sigma-Aldrich公司。全鏈硫代修飾的ODNs和引物由上海生工生物工程有限公司合成。c-Jun AS-ODNs [X17163(gi:57819)]：5'-TTCCATCTTTGCAGTCAT-3'。JunB AS-ODNs[NM_021836(gi:40254774)]：5'-TTCCATTTTCGTGCACAT-3'。JunD AS-ODNs[NM_138875 (gi:58761523)]：5'-ATAGAGGGCGTTTCCAT-3'。c-FosAS-ODNs[X06769(gi:55933)]：5'-GAAACCCGAGAACATCAT-3'。FosB AS-ODNs[NM_001013146(gi: 61557093)]：5'-GGGATAATCCTGGTACAT-3'。Fra-1 AS-ODNs[M19651(gi:204174)]：5'-CCCGAAGTCTCGGTACAT-3'。Fra-2AS-ODNs[U18913(gi:1001950)]：5'-GGGATAATCCTGGTACAT-3'。NS-ODNs:5'-CCCTTATTTACTACTTTC-3'。

1.3 大鼠哮喘模型建立[11]第一天在大鼠后腿內側皮下注射OVA 10 mg和氫氧化鋁200 mg(溶于1 ml生理鹽水中)，同時腹腔注射5×109個/ml滅活的百日咳桿菌疫苗1 ml(作為佐劑)。致敏2周后開始激發：將大鼠置于特制密閉玻璃盒中，霧化吸入2% OVA生理鹽水50 ml，1次/d，30 min/次，連續7 d。以出現煩躁、嗆咳、呼吸加快及輕度紫紺等典型的哮喘發作癥狀為激發成功標準。正常對照組則以生理鹽水代替OVA，余同上。

1.4 基因沉默除外正常對照組和哮喘空白組，激發7 d后每組每天在麻醉狀態下分別從大鼠鼻腔內滴入2 μg/μl c-Jun、JunB、JunD、c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2AS-ODNs及NS-ODNs各100μl，共7d。

1.5 標本采集最后1次激發后24 h內，20%烏拉坦麻醉大鼠。暴露氣管，氣管插管，結扎右肺，行左肺灌洗。每次注入3 ml生理鹽水，回收率約為80%，重復進行3次。收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。取出右肺并凍存于-70℃冰箱。

1.6 嗜酸粒細胞(Eosinophils，EOS)計數所收集BALF在4℃下離心10 min，沉淀經(Haematoxylin-eosin)HE染色，連續計數200個細胞及其中EOS數，得EOS百分比。

1.7 RNA提取和RT-PCR取50～100 mg新鮮肺組織，按試劑說明書操作，采用TRIzol試劑一步法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，以此為模板行PCR擴增。PCR引物：(1)IL-5[X54419(gi:313254)]上游引物：5'-TGAGGATGCTTCTGTGCTTG-3'(510/529)，下游引物：5'-GACTTCCATTGCCCACTCTG-3'(885/ 904)，擴增產物為395 bp。(2)磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) [X02231(gi:56187)]上游引物：5'-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'(337/356)，下游引物：5'-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'(606/625)，擴增產物為289 bp。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s；35個循環；72℃延伸10 min。未逆轉錄的總RNA作為陰性對照，以排除基因組DNA污染。DEPC水取代RNA作為試劑對照。1.5%瓊脂糖凝膠電泳。GDS 800型凝膠成像分析系統(美國UVP公司)分析擴增產物條帶，分別測定各擴增帶A值，將目的基因IL-5擴增帶與內參照GAPDH擴增帶的A值比作為其mRNA水平的定量指標。

1.8 統計學方法數據錄入后，轉到SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(x-±s)表示。采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氣道炎癥哮喘空白組BALF中的EOS百分比[(34.33±9.62)%]顯著高于正常對照組[(5.61± 1.76)%]，差異有統計學意義(P＜0.001)。與哮喘空白組比較，JunB AS-ODNs組的EOS百分比[(13.39± 3.72)%]顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01)，但仍高于正常對照組，差異亦有統計學意義(P＜0.001)。其余ODNs組的EOS百分比與哮喘空白組的差異均無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。

圖1 BALF中EOS百分比

2.2 肺組織IL-5轉錄與正常對照組比較，哮喘空白組IL-5 mRNA表達顯著增加(P＜0.001)。 JunB AS ODNs組的IL-5 mRNA表達低于哮喘空白組，其差異有統計學意義(P＜0.001)；但亦仍高于正常對照組，且其差異亦有統計學意義(P＜0.001)。其余ODNs組IL-5 mRNAs表達與哮喘空白組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1和圖2。

表1 肺組織IL-5 mRNA表達

表1 肺組織IL-5 mRNA表達

注：與正常對照組比較，aP＜0.001；與哮喘空白組比較，bP＞0.05，cP＜0.001

組別正常對照組哮喘空白組c-JunAS ODNs組JunBAS-ODNs組JunDAS-ODNs組IL-5 mRNA(A值比) 0.323 7±0.057 7 0.822 4±0.066 0a0.799 0±0.075 8ab0.554 2±0.082 9ac0.787 0±0.071 9ab組別c-FosAS-ODNs組FosBAS-ODNs組Fra-1AS-ODNs組Fra-2AS-ODNs組NS-ODNs組IL-5 mRNA(A值比) 0.817 9±0.068 8ab0.814 6±0.064 2ab0.788 8±0.067 8ab0.810 4±0.064 6ab0.821 2±0.072 1ab

圖2 肺組織IL-5 mRNA表達

3 討論

沉默JunB基因后，BALF中的EOS百分比顯著降低，IL-5 mRNA表達被顯著抑制，而其余亞單位組均未見此效果。同是AP-1家族成員，JunB在IL-5基因轉錄中不可替代性的原因尚待進一步探討。這有利于提高對廣泛存在的迷人的轉錄因子AP-1的理解和進一步闡明哮喘發病的分子機制。

實驗所選用的AS-ODNs與目的基因mRNAs翻譯起始序列互補，能與mRNA構成雙鏈而阻斷信息翻譯,并具有RNA酶H活性而降解靶RNA[12-14]。AS-ODNs技術為抑制某一特定基因的表達提供了極其特異和快速的方法，適宜于研究細胞內信號轉導，優于信號分子的藥理學抑制劑[14]。

Hartenstein等[15]采用轉基因小鼠，并獲取JunB缺失的CD4+T細胞。在Th2極化培養條件下，經刀豆蛋白A和抗CD3抗體/抗CD28抗體刺激后，與對照組比較，IL-4和IL-5表達顯著減少(尤其是后者)，而IL-13表達的變化不明顯，Th1細胞因子干擾素-γ的表達增加。霧化吸入OVA以激發OVA所致敏小鼠，采用HE染色檢測EOS浸潤和PAS(Periodic acid-Schiff)染色檢測黏液分泌，與對照組比較，JunB缺失小鼠細支氣管周圍EOS浸潤幾乎完全缺失、血管周圍僅見少許EOS、大部分小支氣管中分泌黏液的杯狀細胞減少、黏液分泌顯著減少。我們的研究結果與其相似，并且對7個AP-1亞單位基因進行篩選，發現僅JunB基因沉默能顯著抑制哮喘大鼠慢性氣道炎癥和IL-5 mRNA表達。

盡管JunB基因沉默效果顯著，但檢測指標仍顯著高于正常對照組。一則可能是AS-ODNs技術本身尚不完善(如反義序列位點的選擇、防止被核酶所降解的方法、AS-ODNs長度而非序列依賴的與含聚陰離子結合位點蛋白結合的能力)，二則可能是c-Jun或JunD在一定程度上可替代JunB而與Fos家族成員構成異源二聚體。

Schwenger等[16]選用人T細胞系PER-117細胞，經PMA刺激后，八聚體(Octamer，Oct)-1、Oct-2和AP-1(JunD/Fra-2)結合IL-5啟動子CLEO元件。新合成的Fra-2是IL-5分泌限速因子。共轉染人IL-5啟動子報道質粒和反義核酸質粒后，發現反義Fra-2對IL-5表達的抑制達到75%，而反義JunD則無此影響。人離體T細胞中調控IL-5表達的AP-1亞單位與鼠類不一致，在人肺組織中的情況有待于人肺組織中AP-1亞單位基因篩選研究。

變態反應、氣道慢性炎癥、氣道高反應性和氣道重構是哮喘重要病理生理特征。JunB基因沉默后，可否同時顯著抑制上述四項特征有待深入研究。這有助于揭示該亞單位參與哮喘發病的機制。

綜上所述，JunB亞單位可能決定哮喘大鼠氣道慢性炎癥，可能是新穎治療靶點。

(志謝：衷心感謝廣東醫學院附屬福田醫院檢驗醫學部陳曉燕博士后為此研究所作出的貢獻。)

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Role of JunB in experimental bronchial asthma

LI Hai-yan1*,GUO Qi2*,CHEN Ru-chong3,ZHOU Yi-ping2,LI Ming2,YU Hai-qiong2,JIANG Mei3.1.Department of Primary Care,Futian Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA;2.Department of Respiratory Medicine,Futian Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA;3.Guangzhou Institute of Respiratory Diseases (State Key Laboratory of Respiratory Diseases),Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo determine the key activator protein-1(AP-1)subunit involved in the characteristics of the pathophysiology of asthma,in order to provide more accurate and novel molecular targets for the treatment of asthma.MethodsAsthmatic rat models were employed.One hundred and thirty Wistar male rats were randomly divided into normal control,blank control,c-Jun antisense oligodeoxynucleotides(AS-ODNs),JunB AS-ODNs,JunD AS-ODNs,c-Fos AS-ODNs,FosB AS-ODNs,Fra-1 AS-ODNs,Fra-2 AS-ODNs,and nonsense ODNs groups.After gene silencing,the percentages of eosinophils(EOS)in the bronchoalveolar lavage fluid were calculated using haematoxylin-eosin staining,and interleukin(IL)-5 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe percentage of EOS in JunB AS-ODNs group was decreased significantly as compared with that in the blank control[(34.33±9.62)%vs(13.39±3.72)%,P＜0.001],but was still higher than that in the normal control[(5.61±1.76)%,P=0.04].No significant differences in the percentages of EOS between other ODNs groups and the blank control were observed(P＞0.05).Compared with that in the blank control,the expression of IL-5 mRNA in JunB AS-ODNs group was markedly suppressed[(0.554 2±0.082 9)vs(0.822 4±0.066 0),P＜0.001],which was also still higher than that in the normal control[(0.323 7±0.057 7),P＜0.001].There were no significant differences in the expression of IL-5 mRNA between other ODNs groups and the blank control(P＞0.05).ConclusionChronic airway inflammation in asthmatic rats might depend on JunB,one of the subunits in the family of transcription factor AP-1.JunB might be a novel therapeutic target in asthma.

Activator protein-1(AP-1);Subunits;Antisense oligodeoxynucleotides;Bronchial asthma

R562.2+2

A

1003—6350（2013）06—0781—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0336

2013-01-07)

廣東省醫學科學技術研究基金(編號：A2009621)；深圳市科技計劃重點項目(編號：200901023)、福田區公益性科研項目(編號：FTWS201040)

*同等貢獻作者

郭琦。E-mail:qiguo88@hotmail.com